氧化白藜芦醇协同抗坏血酸抑制余甘子酶促褐变的机制研究

陈 军，陈洪彬，郭凤仙，郑瑞生，林河通，郑宗平*

（1 福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室 泉州师范学院海洋与食品学院 福建泉州 362000 2 福建农林大学食品科学学院 福州 350002）

余甘子（Phyllanthus emblica）为大戟科植物余甘子的果实，为热带、亚热带地区特色水果，在我国主要分布在福建、广西、广东、云南、海南等省份[1]。 余甘子具有健胃止咳、清热凉血、治疗血瘀、减轻腹疼、缓解喉咙干疼、清新口腔的药用价值[2-4]。现代药理研究表明，余甘子对高血压[5]、糖尿病[6]具有一定的预防和治疗作用，并且具有抗病毒[7]、抗炎[8]、抗肿瘤[9]、抗氧化[10]、抗癌[11]、护肝[12]等功效。 现有研究主要集中在余甘子的药理作用和药用价值，而对余甘子采后加工贮藏及抗褐变鲜有研究。余甘子采后在加工和贮藏过程中逐渐变黄，形成果实褐变，在余甘子果汁饮料加工过程中，随着时间的延长，会出现褐色沉淀，影响其感官、营养价值。因此，减缓余甘子在采后贮藏和加工过程中的褐变问题，对余甘子资源的开发具有重要意义。

酶促褐变是引起果蔬褐变的重要原因，主要通过多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶等酶以及氧气的参与，将酚类物质氧化成醌类物质，醌类物质进一步氧化聚合或通过非酶促褐变反应与蛋白质等大分子物质聚合缩合，形成褐变物质，导致果蔬的营养、感官、经济价值降低[13]。 抑制酶促褐变可从氧气、酚类物质和褐变酶等3 个方面入手，通过隔绝氧气、钝化酶活性、抑制酶的活性等手段抑制或减缓酶促褐变的发生，通过阻止酶、底物、氧气同时存在且相互接触的方法阻止酶促褐变的发生[14]。

氧化白藜芦醇（Oxyresveratrol，OXY）为二苯乙烯类物质，前期研究表明，OXY 对多酚氧化酶有很强抑制作用，抑制活性远胜于曲酸[15-16]。 Wang等[17]以酪氨酸为底物，研究OXY 对PPO 的抑制机制为可逆的混合型抑制。 近几年，OXY 被广泛应用于水果、蔬菜的抗褐变研究，结果表明其有很好的效果。 陈春等[18]研究OXY 对苹果鲜切片及鲜榨果汁的抗褐变作用，表明OXY 对贮藏期苹果的多酚氧化酶活性、 过氧化物酶活性有较好的抑制作用，能显著降低褐变度。 在实际应用中，复合护色剂对果蔬的鲜切片或鲜榨果蔬汁进行护色有更好的效果，He 等[19-20]利用OXY 和抗坏血酸（VC）对藕片、葡萄汁的抗褐变效果，研究表明，复合使用的抗褐变效果比单独使用OXY 更好。 Li 等[21]也发现单独使用OXY 对苹果鲜切片抗褐变效果没有联合使用OXY+VC 的效果好。 到目前为止，研究者多以单一抑制剂对多酚氧化酶进行抑制研究，而利用复合抑制剂对多酚氧化酶抑制机制的研究鲜有报道。 本研究采用OXY 联合VC 对余甘子切片进行抗褐变研究，同时研究其酶抑制动力学，探明OXY 联合VC 对余甘子的多酚氧化酶的协同抑制机理，为余甘子采后贮藏和加工过程中抗褐变提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

余甘子（品种为“玻璃甘”），泉州水果批发市场；二甲基亚枫（DMSO）、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、抗坏血酸（VC）、创愈木酚、苯丙氨酸、焦性没食子酸、4-己基间苯二酚（4-HR）、PPO，Sigma 公司；30%过氧化氢、盐酸（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司；氧化白藜芦醇，上海源叶生物有限公司；试验用水为去离子水。

ZRX-260 低温人工气候箱，宁波赛福实验仪器有限公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；H2050R 型台式高速大容量冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Infinite M200 Pro 酶标仪，瑞士帝肯公司；ADCI 系列全自动色差计，北京辰泰克仪器技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 余甘子切片的L 值、△E 的测定 挑选大小、成熟度一致，无机械损伤的新鲜余甘子，洗净，切成直径约为2～3 cm 的余甘子果片，将切好的余甘子切片浸泡于500 mL 待护色溶液中，3 min 后取出沥干，放于塑料平板上，于室温下晾干后，置于相对湿度为85%，温度为25 ℃恒温恒湿培养箱中贮藏，经预试验，测试样品包括去离子水（CK）、0.02%OXY、0.01%4-HR、0.15%VC、0.02%OXY+0.15%VC、0.01%4-HR+0.15%VC 溶液。

将浸泡护色液后晾干的余甘子切片用ADCI色差计测量余甘子切片的L（亮度）、a（红-绿）和b（黄-蓝）值，在间隔时间为0，6，12，18，24，30，36 h 时，分别测出其色差值，不同组样品各测量10个不同余甘子切片，取平均值，△E 代表不同样品总色差度，计算公式如下[22]：

式中，△E——总色差度；Lt、at、bt——t 时刻的L、a、b 值；L0、a0、b0——0 时刻的L、a、b 值。

1.2.2 余甘子切片褐变度的测定 参照关正萍等[23]的方法略有改动，将经液氮处理的余甘子果片用万能粉碎机粉碎，各组称取2 g 余甘子粉末，冰浴研磨，12 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液，定容10 mL 后，经酶标仪测定在420 nm 波长处的吸光值，平行操作3 次，以每克鲜重在波长420 nm 处吸光值表示褐变度（OD420nm/g）。

1.2.3 余甘子切片PPO、POD、PAL 的提取 将经液氮处理的余甘子果片用万能粉碎机粉碎，各组称取2 g 余甘子粉末用含2%PVPP，0.1%VC，磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合配制而成，pH 6.8）冰浴研磨，经2 000 r/min 离心15 min，取上清液，定容至10 mL，制得粗酶液。

1.2.4 余甘子切片PPO 活性的测定 酶的活性测定方法参照谢征芸等[24]的方法略有改动，即向试管中加入1 mL 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）配成的0.1 mol/L 的焦性没食子酸溶液，1.5 mL 磷酸盐缓冲液（pH 6.8），放入30 ℃水浴2 min 后，以去离子水做参比液，加入0.5 mL 酶液，立刻测试在420 nm 波长下的吸光值，测试之后立刻倒回试管，放入30 ℃水浴锅中，反应5 min 后，立刻测定420 nm 波长下的吸光值，平行操作3 次，定义每分钟每克余甘子酶促反应吸光值增加0.001 为1 个酶活力单位（U），PPO 活性单位为U/g·min。

式中，△A420nm——酶反应前、 后吸光值之差；VT——酶液提取的总体 （mL）；M——待测材料的质量（g）；Vs——测定时所取样品提取液体积（mL）；T——反应时间（min）。

1.2.5 余甘子切片POD 的测定 过氧化物酶活性测定参照曹健康等[25]方法略有改动，吸取3.0 mL 由磷酸盐缓冲液 （pH 6.8） 配成的25 mmol/L愈创木酚溶液和0.1 mL 酶液，置于30 ℃水浴2 min，加入0.1 mL 2 mol/L 的H2O2溶液，将反应混合液迅速倒入比色皿，在475 nm 波长下测定吸光值，结果记为OD0，以去离子水为参比液，测量后倒回试管，在30 ℃下水浴预热5 min 后，测量反应溶液吸光值，记为OD1，做差得△A475nm，以每分钟每克余甘子酶促反应吸光值增加0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U），平行操作3 次，POD 活性单位为U/g·min。

式中，△A475nm——酶反应前、 后吸光值之差；V——酶液提取的总体和（mL）；Vs——测定时所取样品提取液的体积（mL）；t——反应时间（min）；m——待测材料的质量（g）。

1.2.6 余甘子切片PAL 活性的测定 酶液提取同1.2.3 节的方法，PAL 活性测定参照曹健康等[25]的方法，平行操作3 次，PAL 活性单位为U/g·h。

式中，OD1——反应60 min 后的吸光值；OD0——反应0 min 时的吸光值；V——样品液提取的总体积（mL）；Vs——测定时所取样品提取液体积（mL）；T——酶促反应时间（h）；m——样品质量（g）。

1.2.7 OXY、OXY+VC 对PPO 抑制活性的测定 参考张龙[26]的方法，并做适当修改。 将抑制剂样品溶解于DMSO 中配制成1 mmol/L 的溶液，用去离子水稀释成所需浓度。 然后将底物L-DOPA 和PPO溶解在磷酸盐缓冲溶液（pH 6.8）中，分别配成浓度为1 mmol/L 和200 U/mL 的溶液，4 ℃避光保存待用。 先在试管中加入3.0 mL 底物L-DOPA 溶液，然后向其中添加100 μL 不同浓度的OXY、OXY+VC 溶液，用漩涡混匀器混匀，放置于30 ℃水浴锅中温浴2 min，最后加入100 μL PPO 溶液，立刻混匀，用紫外可见分光光度计于475 nm波长处测定吸光值，在30 ℃恒温条件下继续反应10 min 后，再次测定体系在475 nm 波长处吸光度，平行操作3 次。 100 μL DMSO 代替体系中的OXY、OXY+VC 溶液作为空白对照；不同浓度曲酸（KA）、KA+VC 溶液作为阳性对照。 IC50为使PPO活力下降至50%时OXY、OXY+VC 的浓度。 采用公式（5）计算化合物对PPO 活性的抑制率：

式中，A1——空白组0 min 的吸光度；A2——空白组10 min 后的吸光度；B1——样品组0 min的吸光度；B2——样品组10 min 后的吸光度。

1.2.8 OXY+VC 相互作用的评价 参考王庆华等[27]的方法略有改动，两种复合抑制剂对PPO 的作用，用相互作用系数γ 表示，当γ﹥1 时，表示为拮抗作用，当γ﹤1 时，表示为协同作用。 γ 值越大，表明拮抗作用越强，γ 值越小，表示协同作用越强。

式中，IC50A、IC50B——分别表示抑制剂A、B 单独使用时，对PPO 抑制率为50%时的质量浓度（μmol/L）；IC50a、IC50b——分别表示抑制剂A、B 复合使用时，对PPO 抑制率为50%时的质量浓度（μmol/L）。

1.2.9 OXY、OXY+VC（1∶7）对PPO 抑制作用方式的测定 参照张龙[26]方法略有改动。 加入3.0 mL由磷酸盐缓冲液（pH 6.8）配成的浓度为1 mmol/L的L-DOPA，然后加入100 μL 不同浓度的抑制剂，30 ℃水浴2 min，加入100 μL 不同浓度的PPO，立刻混匀，用紫外可见分光光度计于475 nm 波长处测定吸光值，在30 ℃恒温条件下继续反应10 min 后，再次测定体系吸光度，测定体系吸光值变化，用酶促反应速度V （OD475nm/min）与PPO 的浓度作图，根据曲线特点判断该抑制剂对PPO 的抑制作用方式。 若得到一组相交于原点的直线，则抑制剂对PPO 的抑制方式为可逆抑制；若得到一组不相交的平行直线，则为不可逆抑制。

1.2.10 OXY、OXY+VC 对PPO 抑制类型和抑制常数的测定 参照张龙[26]方法略有改动，向试管中加入3 mL 不同浓度的L-DOPA 溶液，在30 ℃水浴条件下，测定不同浓度的抑制剂对PPO 活力的影响，此时PPO 溶液加入量是0.1 mL，浓度为200 U/mL，最后采用以L-DOPA 浓度的倒数S-1为横坐标，以酶促反应速率（OD475nm/min）的倒数V-1为纵坐标的双倒数作图法作图，根据图形特点来判断抑制类型。 以直线的斜率（Slope）和纵坐标的截距（Intercept）分别对抑制剂浓度进行二次作图，可求得相应的抑制剂对游离酶的抑制常数KI以及对酶-底物复合物的抑制常数KIS，如公式（7），（8）所示：

式中，Km——米氏常数；Vmax——最大反应速度 （mol/L·min）；[I]——抑制剂浓度（mol/L）；KI——抑制剂对游离酶的抑制常数（μmol）；KIS——酶-底物复合物的抑制常数（μmol）。

1.2.11 数据处理 数据经过Excel 处理，经Sigma.Plot 12.5 软件绘制，显著性差异经SPSS Statistics 22.0 软件处理。

2 结果与分析

2.1 OXY 协同VC 对余甘子L 值、△E 值的影响

从图1a 可以看出，随着时间的延长，各处理组的L 值均呈下降趋势，对照组（CK）L 值下降最快且最低，OXY+VC 处理组的L 下降最慢且最高，OXY、4-HR+VC、VC、4-HR 处理组的余甘子L 值依次降低。 0～6 h，OXY、VC、OXY+VC、4-HR+VC处理 组的L 值相差不大；6～12 h 期间，OXY 和OXY+VC 联合处理组的L 值仍相差不大，然而VC、4-HR+VC 处理组L 值下降速度变快；从12 h开始，OXY 处理组L 值与OXY+VC 联合处理组差距逐渐加大，OXY+VC 复合处理组的余甘子L 值均高于OXY、VC 单独处理组，表明OXY 联合VC后，对抑制余甘子切片L 值下降的效果比单独使用更佳。

图1 OXY 协同VC 对余甘子L 值（a）、△E 值（b）的影响Fig.1 Effects of OXY + VC on L value （a），△E （b） values of P.emblica

从图1b 可以看出，各组的△E 值均随着时间的延长而增加。 在0～12 h，OXY、VC、OXY+VC、4-HR、4-HR+VC 组的△E 值相差不大；12～36 h，4-HR 组的△E 值高于VC、4-HR+VC。 总体来看，CK、4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 组 的△E 值依次降低，表明4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 均对余甘子的△E 值的上升有抑制作用，单独组余甘子切片的△E 值高于联合组，表明联合使用对余甘子切片△E 值升高的抑制作用比单独使用强。

2.2 OXY 协同VC 对余甘子褐变度的影响

褐变度是褐变现象最直观的表现，褐变度高表示褐变程度大，对产品造成的视觉效果最为明显，是影响感官价值的直接指标。 从图2 可以看出，各组的褐变度值均随着时间的延长而增加，在0～6 h，各组的褐变度缓慢增加，6～24 h 期间快速增加，24～36 h 呈缓慢增加的趋势。 在0～12 h，OXY、OXY+VC 组的褐变度没有明显变化且两组的褐变度值相差不大，其它组的褐变度值快速增加且高于OXY、OXY+VC 组，说明在0～12 h，OXY、OXY+VC 能明显抑制余甘子切片褐变现象的发生；12～36 h，OXY、OXY+VC 组的褐变度快速增加，且OXY+VC 组的褐变度值略低于OXY 单独组，说明OXY 联合VC 处理和OXY 单独处理对余甘子切片的褐变度值的影响在贮藏后期相差不大。

图2 OXY 协同VC 对余甘子褐变度的影响Fig.2 Effects of OXY + VC on browning degree of P.emblica

2.3 OXY 协同VC 对余甘子PPO、POD、PAL的影响

PPO 是引起褐变的关键酶，其活性的高、低与褐变程度呈正相关。 从图3a 可以看出，在0～6 h，除CK 组外，各组的余甘子PPO 活性较低且变化不大，相差不明显，说明在贮藏早期，各组对余甘子PPO 的活性有较好的抑制作用；6～18 h，各组的余甘子PPO 活性剧烈增加；18～36 h，各组的余甘子PPO 活性缓慢降低，在18 h 时，PPO 活性达到最高。 与各组相比，CK 组的余甘子PPO 活性最高，OXY+VC 组的余甘子PPO 活性最低，由此可知，联合处理组的余甘子PPO 活性低于其单独处理组的PPO 活性，说明OXY+VC 联合处理对余甘子中的PPO 的抑制活性能力强于OXY、VC 单独处理组。

图3 OXY 协同VC 对余甘子PPO（a），POD（b），PAL（c）活性的影响Fig.3 Effects of OXY+ VC on PPO（a），POD （b），PAL （c） activity of P.emblica

POD 是引起余甘子褐变现象的另一关键性酶，在细胞内活性氧代谢的条件下，产生过氧化氢，能作为过氧化物酶反应的启动子，能使过氧化物酶迅速与酚类物质反应，形成褐变物质，从而影响感官。 从图3b 可以看出，各组POD 活性均呈先增加后减少的趋势，在18 h 时活性最高。 在0～6 h，各组的余甘子POD 活性较低且相差不大；在6～36 h，4-HR+VC 组的POD 活性远低于4-HR 组，OXY 单独组的POD 活性远高于OXY+VC 组。 在整个贮藏期间，OXY+VC 组的POD 维持在较低水平，数据表明，各组均对余甘子切片的POD 活性有抑制作用，OXY、VC 联合处理比单独处理对余甘子POD 活性抑制效果强。

PAL 能将苯丙氨酸转化为酚类物质，酚类物质能作为酶促反应的底物，因此苯丙氨酸与褐变现象的发生有密切关系，其活性最高，表明非酚类物质向酚类物质转化越多，酶促褐变反应底物越充足。 从图3c 可以看出，各组的PAL 活性随着时间的延长，均呈下降趋势，CK 组的PAL 活性保持较高水平，高于其它组，在0～6 h，4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 组的余甘子切片PAL 活性迅速下降； 在6～18 h，4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 组的余甘子切片PAL 活性缓慢下降；18～36 h，又快速下降。 在整个贮藏期内，OXY、VC 与OXY+VC组相比，VC、OXY单独处理组PAL 活性高于OXY+VC 处理组，表明OXY+VC 联合处理对余甘子切片中的PAL 活性抑制作用强于OXY、VC 单独处理。

2.4 OXY 协同VC 对PPO 活性的抑制作用

从图4 可以看出，在OXY、OXY+VC（1 ∶7）溶液浓度为0～5 μmol/L 时，随着浓度的增加，PPO活性迅速减少，其中在相同浓度下，OXY+VC（1 ∶7） 对PPO 活性的抑制作用强于OXY、VC 单独处理。 KA、KA+VC（1∶7）、OXY、OXY+VC（1 ∶7）溶液处理的IC50值分别为 （70.005±0.805）μmol/L，（48.300 ±1.300）μmol/L，（3.300 ±0.010）μmol/L，（1.600±0.020）μmol/L。 与阳性对照KA 和KA+VC（1 ∶7） 相比，KA 的IC50是OXY 的21.210 倍，是OXY+VC（1 ∶7）的43.750 倍；而KA+VC（1 ∶7）是OXY 的14.630 倍，是OXY+VC （1∶7） 的30.188倍。 综合来看，各抑制剂对PPO 的抑制强弱能力为OXY+VC﹥OXY﹥KA+VC（1∶7）﹥KA。 OXY 为强PPO 抑制剂，OXY 联合VC 处理后对PPO 抑制作用加强且差异显著（P﹤0.05）。

图4 曲酸（a）和氧化白藜芦醇（b）对余甘子PPO 的抑制作用Fig.4 Inhibition effects of kojic acid （a） and oxyresveratrol （b） on PPO of P.emblica

2.5 OXY、VC 对PPO 抑制的相互作用的评价

经计算得到γ OXY+VC （1∶7）=0.5044＜1，表明OXY 与VC 对PPO 的抑制作用有较好的协同作用，这可能与OXY 和VC 均有不饱和乙烯类共价键有关，既可以失去电子，又可以得到电子，两者相互促进，加强了对PPO 的抑制作用。

2.6 OXY、OXY+VC 对PPO 抑制方式的研究

从图5 可以看出，通过对酶浓度和酶促反应速度作图，所有的图形均经过原点，随着抑制剂浓度的增加，斜率逐渐降低，表明OXY、OXY+VC 对PPO 活性的抑制作用均为可逆的，PPO 的活性下降是由于抑制剂的浓度增加所致，而不是由于PPO 有效酶活力减少所致。

图5 OXY （a）和OXY+VC （1∶7） （b）对PPO 的抑制方式Fig.5 Inhibition mode of OXY （a） and OXY+VC （1∶7） （b） on PPO

2.7 OXY、OXY 协同VC 对PPO 抑制类型及抑制常数的测定

2.7.1 OXY 对PPO 抑制类型及抑制常数的测定

由图6a 可知，通过双倒数研究OXY 对PPO 作用获得在第二象限相交的一组直线，说明随着OXY 浓度的增加，导致Km值变大而Vmax逐渐变小，说明OXY 对PPO 的抑制类型是混合型抑制，与文献[16]报道一致。 表明OXY 既可以与游离的PPO 活性中心结合，阻止底物与酶接触，又可以与PPO 和底物形成的复合物结合，阻止褐变物质的形成。 以OXY 浓度和各直线的斜率进行二次作图，得到图6b，结合公式（7，8）可求出OXY 对游离的PPO 的抑制常数KI为0.904 μmol/L；以各直线y 轴的截距对OXY 浓度进行二次作图得图6c，并结合公式（7，8）求出OXY 对酶-底物复合物的抑制常数KIS值为14.285 μmol/L。 抑制常数越小越好，KIS﹥KI，表 明OXY 对PPO 的 结合能力比OXY 对PPO-底物复合物的结合能力强。

图6 OXY 对PPO 抑制类型（a）、抑制常数KI（b）、KIS（c）测定Fig.6 Determination of PPO inhibition type （a） and inhibition constant KI （b），KIS （c） of OXY

2.7.2 OXY+VC 对PPO 抑制类型及抑制常数的测定 通过双倒数作图法研究OXY+VC （1∶7）对PPO 的抑制类型，可得到一组相交于y 轴同一点的直线，如图7a 所示，说明OXY+VC（1∶7）对PPO的作用是竞争性抑制类型。 以各直线的斜率对OXY+VC（1 ∶7）浓度进行二次作图可得到一条线性良好的直线，如图7b 所示，表明OXY+VC（1∶7）对PPO 的抑制位点是单一的或单一类型的位点。通过这条直线结合公式（7，8），求得OXY+VC（1 ∶7）对PPO 的抑制常数KI值为0.840 μmol/L。

图7 OXY+VC（1∶7）对PPO 抑制类型（a）及抑制常数KI（b）的测定Fig.7 Determination of PPO inhibition type （a） and inhibition constant KI （b） of OXY+VC （1∶7）

3 结论

氧化白藜芦醇（OXY）和抗坏血酸（VC）能减缓余甘子在加工和贮藏过程中褐变现象的发生，二者联合处理对余甘子切片的褐变有较好的抑制效果，其途径主要通过抑制余甘子中的PPO、POD、PAL 活性，尤其是抑制PPO 的活性。 通过酶抑制动力学研究发现，OXY 和OXY+VC 对PPO的抑制方式均为可逆抑制，OXY 对PPO 的抑制为混合型抑制，与文献报道[16]一致。有趣的是，通过添加VC 后，OXY 与VC 联合使用对PPO 的抑制由混合型抑制变为竞争性抑制，这种联合使用方式不仅提高了OXY 抗褐变能力，同时也改变了其对酶的作用方式。