CD4+NKG2D+ T细胞在幼年特发性关节炎疾病活动中的作用

王君言 朱晓萍 张宇 罗冲 唐雪梅 周娟

（1.重庆医科大学附属儿童医院风湿免疫科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿童感染免疫重庆市重点实验室/儿童发育疾病研究教育部重点实验室，重庆 400014；2.贵州医科大学附属医院贵州省儿童医学中心，贵州贵阳 550004）

幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）是儿童时期常见的以慢性滑膜炎为主要特征的风湿性疾病，也是儿童后天致畸和致盲的首要原因，2001年国际风湿病联盟将JIA分为7个亚型，以全身型、多关节型、少关节型最为多见［1］。目前JIA发病机制尚不完全清楚，认为与T细胞过度活化所致的炎症损伤相关。T细胞活化需双信号刺激，除第一信号T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别抗原肽外，还需T细胞表面协同刺激分子与抗原提呈细胞表面配体结合提供第二信号。自然杀伤细胞活化性受体2D（naturalkiller group 2 member D，NKG2D）是T细胞表面提供协同刺激信号的重要受体，最初认为是自然杀伤细胞表面活化性受体，后逐渐发现可广泛表达在CD8+T、γδ+T等细胞表面，而CD4+T细胞表面通常不表达或低水平表达，仅在感染、肿瘤、自身免疫性疾病等情况下出现NKG2D表达，提供协同刺激信号活化CD4+T细胞［2-4］。NKG2D特异性配体MHC-Ⅰ类链相关分子A和B（MHC class I chainrelated molecules A/B，MICA/MICB）也是在上述情况诱导下表达增加。

近年来有关于CD4+NKG2D+T细胞参与系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、炎症性肠病、糖尿病等多种自身免疫性疾病的报道［5］，但尚无与JIA疾病相关的报道。本研究通过检测JIA患儿外周血CD4+NKG2D+T细胞比例及NKG2D可溶性配体，即可溶性MHC-Ⅰ类链相关分子A和B（soluble MHC class I chain-related molecules A/B，sMICA/sMICB）表达水平，初步探讨CD4+NKG2D+T细胞在JIA疾病活动中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

前瞻性纳入2019年11月—2021年12月重庆医科大学附属儿童医院风湿免疫科门诊及住院部的JIA患儿39例作为研究对象。JIA患儿符合2001年国际风湿病联盟修订的JIA诊断及分类标准［6］，包括全身型JIA 19例、关节型JIA（多关节型、少关节型）20例，除外感染、恶性疾病、免疫缺陷病、外伤及其他风湿免疫性疾病等。选取同期该院年龄、性别相匹配的健康儿童6例作为对照组。对照组纳入标准：（1）年龄<16岁；（2）近半年内无其他疾病史。本研究已通过重庆医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准（025/2014）；在招募受试者前，法定监护人均知情并同意参与研究。

1.2 外周血CD4+NKG2D+ T淋巴细胞检测

采用密度梯度离心法提取对照组6例健康儿童和JIA组21例患儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。JIA组21例患儿包括全身型JIA活动期5例，全身型JIA稳定期6例，关节型JIA活动期及稳定期各5例。取PBMC 100 μL至1.5 mL EP管中，加入CD4-PE抗体、NKG2D-FITC抗体充分混匀后，4℃避光孵育30 min，1 000 rpm离心5 min，重复洗涤3次后重悬。采用BD FACS流式细胞仪进行检测，应用CellQuest软件进行数据分析。

1.3 血清sMICA和sMICB检测

收集JIA组中21例患儿，包括全身型JIA活动期6例，全身型JIA稳定期4例，关节型JIA活动期5例及关节型JIA稳定期6例，以及6例健康儿童外周血，分离血清。采用酶联免疫吸附法检测sMICA和sMICB表达水平，测定试剂盒购自北京丽科创欣生物科技有限公司。

1.4 临床资料收集

收集JIA患儿临床资料，包括年龄、性别、JIA亚型、临床体征及实验室检查结果。实验室检查包括白细胞计数（white blood cell，WBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板计数（platelet，PLT）、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）。采用幼年关节炎疾病活动评分-27（Juvenile Arthritis Disease Activity Score-27，JADAS-27） 及全身型幼年关节炎疾病活动评分-27（systemic Juvenile Arthritis Disease Activity Score，sJADAS-27）［7］分别计算关节型及全身型JIA疾病活动性评分。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行数据处理与分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，满足方差齐性者组间比较采用单因素方差分析或两样本t检验，方差不齐者组间比较采用Kruskal-Wallis检验。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验或Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用Fisher确切概率法。以上组间两两比较采用Bonferroni校正。采用Pearson相关分析探讨CD4+NKG2D+T细胞、sMICA、sMICB与sJADAS-27/JADAS-27评分的相关性。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve，AUC）分析各指标对JIA疾病活动性判断的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床表现

39例JIA患儿中，全身型JIA活动期12例，全身型JIA稳定期7例，关节型JIA活动期12例，关节型JIA稳定期8例。JIA各组发热、皮疹、淋巴结肿大发生比例和受累关节个数的比较差异有统计学意义（均P<0.05），其中全身型JIA活动期组发热、皮疹、淋巴结肿大发生比例高于其他3组（P<0.05），关节型JIA活动期组受累关节个数多于全身型JIA稳定期组（P<0.05）和关节型JIA稳定期组（P<0.05），见表1。

表1 JIA各组的临床表现比较

2.2 实验室检查结果

JIA各组Hb、中性粒细胞绝对计数、淋巴细胞绝对计数、CRP、ESR、白蛋白含量的比较差异有统计学意义（均P<0.05）：其中全身型JIA活动期组Hb、淋巴细胞绝对计数、白蛋白含量较关节型JIA稳定期组下降（P<0.05），中性粒细胞绝对计数、CRP、ESR较关节型JIA稳定期组升高（P<0.05）；关节型JIA活动期组ESR较关节型JIA稳定期组升高（P<0.05）。见表2。

表2 JIA各组实验室检查结果比较 ［M（P25，P75）］

2.3 CD4+NKG2D+ T淋巴细胞计数

与对照组相比，全身型JIA稳定期组及关节型JIA稳定期组CD4+NKG2D+T细胞比例有一定程度升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。全身型JIA活动期组及关节型JIA活动期组CD4+NKG2D+T细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。见表3。

JIA组间比较显示，全身型JIA活动期组及关节型JIA活动期组CD4+NKG2D+T细胞比例较各自稳定期组升高，差异有统计学意义（P<0.001）；关节型JIA活动期组较全身型JIA活动期组升高，差异有统计学意义（P<0.001）。见表3。

表3 各组CD4+NKG2D+ T细胞比例的比较（± s，%）

表3 各组CD4+NKG2D+ T细胞比例的比较（± s，%）

注：a示与对照组比较，P<0.001；b示与全身型JIA活动期组比较，P<0.001；c示与关节型JIA活动期组比较，P<0.001。

images/BZ_66_272_2417_661_2476.pngimages/BZ_66_272_2535_661_2595.pngimages/BZ_66_272_2654_661_2772.pngimages/BZ_66_661_2417_838_2476.pngimages/BZ_66_661_2535_838_2595.pngimages/BZ_66_661_2654_838_2772.png组别对照组全身型JIA稳定期组关节型JIA稳定期组例数6 6 5 CD4+NKG2D+ T细胞比例0.038±0.027 18.956±10.365a,c 0.345±0.408b 38.018±4.651a 8.652±1.101c 25.006<0.001

2.4 各组sMICA和sMICB水平的比较

与对照组相比，JIA各组sMICA和sMICB表达水平均增加，差异有统计学意义（P<0.001）。JIA组间比较显示，关节型JIA活动期组sMICB水平高于关节型JIA稳定期组，差异有统计学意义（P=0.022）。见表4。

表4 各组sMICA和sMICB水平的比较 （± s）

表4 各组sMICA和sMICB水平的比较 （± s）

注：［sMICA］可溶性MHC-Ⅰ类链相关分子A；［sMICB］可溶性MHC-Ⅰ类链相关分子B。a示与对照组比较，P<0.001；b示与关节型JIA活动期组比较，P<0.05。

images/BZ_66_1320_1705_1672_1764.pngimages/BZ_66_1320_1823_1672_1882.pngimages/BZ_66_1320_1941_1672_2059.pngimages/BZ_66_1672_1705_1792_1764.pngimages/BZ_66_1672_1823_1792_1882.pngimages/BZ_66_1672_1941_1792_2059.pngimages/BZ_66_1792_1705_2040_1764.pngimages/BZ_66_1792_1823_2040_1882.pngimages/BZ_66_1792_1941_2040_2059.png组别对照组全身型JIA稳定期组关节型JIA稳定期组例数6 4 6 sMICA (ng/mL)8.5±1.4 30.8±12.2a 27.8±8.7a sMICB (pg/mL)96±9 280±54a 240±22a 319±33a 247±73a,b 17.170<0.001

2.5 各指标与sJADAS-27/JADAS-27评分的相关性分析

全身型JIA活动期组sJADAS-27评分均值高于全身型JIA稳定期组，差异有统计学意义［（23±6）分vs（7±4）分，t=6.395，P<0.001］；关节型JIA活动期组JADAS-27中位评分高于关节型JIA稳定期组，差异有统计学意义［22（18，31）分vs 2（2，9）分，Z=-3.680，P<0.001］。

39例JIA患儿CD4+NKG2D+T细胞比例、sMICA水平、sMICB水平、ESR与sJADAS-27/JADAS-27评分呈正相关（P<0.05），Hb、白蛋白含量与sJADAS-27/JADAS-27评分呈负相关（P<0.05），WBC和CRP与sJADAS-27/JADAS-27评分无明显相关性（P>0.05），见表5。

表5 各指标与sJADAS-27/JADAS-27评分的相关性

2.6 JIA疾病活动性评估

应用ROC曲线分析CD4+NKG2D+T细胞、sMICA、sMICB等指标对JIA疾病活动性评估的价值。结果显示，sJADAS-27/JADAS-27评分、ESR、Hb、sMICB对JIA疾病活动性评估的AUC分别为0.967、0.850、0.773、0.755。除Hb外，其余3项评估指标的特异度均高达0.90，灵敏度波动在0.64~0.90之间。CD4+NKG2D+T细胞比例和sMICA对JIA疾病活动性评估无统计学意义（分别P=0.974、0.139）。见图1和表6。

图1 各项指标对JIA疾病活动性评估价值的ROC曲线分析 Score为sJADAS-27/JADAS-27疾病活动性评分；Hb为血红蛋白；ESR为红细胞沉降率；sMICB为可溶性MHC-Ⅰ类链相关分子B。

表6 各项指标对JIA疾病活动性评估的价值

3 讨论

JIA是一组高度异质性疾病，临床表现及实验室检查结果多样化，目前缺乏特异性生物学指标用于JIA诊断及疾病活动性评估。大量研究发现NKG2D信号通路在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用，CD4+NKG2D+T细胞及NKG2D可溶性配体水平在SLE、RA等患者外周血和局部组织中显著增加，且与原发病疾病活动性呈正相关。抗体阻断NKG2D与配体的活化后，疾病活动得到部分缓解［8-18］，提示CD4+NKG2D+T细胞是自身免疫性疾病中重要的炎症反应细胞，靶向CD4+NKG2D+T细胞是治疗自身免疫性疾病的新途径。但也有学者发现CD4+NKG2D+T细胞作为免疫调节细胞与SLE疾病活动性呈负相关［19-20］。因此，CD4+NKG2D+T细胞在自身免疫性疾病中的作用尚有争议。

本研究探讨CD4+NKG2D+T细胞及NKG2D配体在儿童常见的自身免疫性疾病JIA中的作用，发现全身型JIA活动期患儿及关节型JIA活动期患儿外周血CD4+NKG2D+T细胞比例及sMICA、sMICB水平较健康对照组及各自稳定期组增加，并且与sJADAS-27/JADAS-27疾病活动性评分呈正相关，提示CD4+NKG2D+T细胞及NKG2D配体活化的信号介导JIA炎症反应，是JIA疾病活动的新型生物学标志。ROC曲线分析显示，sMICB对JIA疾病活动性评估有一定价值。因此，CD4+NKG2D+T细胞及sMICA、sMICB水平的监测对JIA疾病活动性评估有潜在临床应用价值，相较于CD4+NKG2D+T细胞及sMICA，sMICB表达升高对JIA疾病活动性评估更有提示意义。因此，sMICB可作为JIA疾病活动性评估的新指标。

JIA不同亚型间临床表现迥异一直以来都是研究热点，目前认为与全身型JIA及关节型JIA发病免疫性机制不同密切相关。全身型JIA更倾向于天然免疫介导的自身炎症性疾病，关节型JIA则是适应性免疫介导的自身免疫性疾病。本研究发现关节型JIA活动期组CD4+NKG2D+T细胞比例及sMICA、sMICB水平较全身型JIA活动期组高。NKG2D 配体主要表达在滑膜细胞表面［9-10，12］，在JIA中介导慢性滑膜病变。因此NKG2D参与的CD4+T细胞活化在关节型JIA中的作用更突出，可能是JIA关节滑膜慢性损伤的机制之一。此外，本研究还发现关节型JIA活动期组sMICB水平较关节型JIA稳定期组升高，提示NKG2D-MICB可能是关节型JIA疾病活动的重要炎症反应，sMICB水平的检测对关节型JIA疾病活动性评估更有临床价值。本研究的局限性在于纳入样本量偏少，且未能进一步细化关节型JIA分组，未来可扩大样本量检测CD4+NKG2D+T细胞及NKG2D配体在不同亚型JIA疾病活动中的作用。

综上，CD4+NKG2D+T细胞及NKG2D配体介导的炎症反应是JIA疾病的免疫学机制之一，在关节型JIA中的作用可能较全身型JIA更为突出，可作为JIA疾病活动性评估的新型生物学标志。