采用全基因组测序技术快速诊断危重症新生儿的临床实践

肖非凡 卢宇蓝 吴冰冰 董欣然 程国强 胡黎园 周文浩, 彭小敏 杨琳 王慧君

（国家儿童医学中心/复旦大学附属儿科医院 1.分子医学中心；2.新生儿科，上海 201102）

儿童是遗传性疾病的高发人群［1-2］，遗传因素是导致危重症新生儿早期死亡的重要原因［3］。但是，遗传性疾病在生命早期的临床表现缺乏特异性，临床诊断困难。因此，早期明确是否存在遗传性病因，对危重症新生儿的治疗及预后至关重要［4］。目前，快速基因检测技术已在危重症新生儿疾病诊断方面具有良好的应用［5］。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）可检测整个基因组的编码区和非编码区序列，是检测范围最广的技术，可为遗传性疾病的诊断提供更为全面的线索［6-7］。本文旨在通过临床的应用研究，探索WGS在临床快速诊断危重症新生儿中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究为前瞻性研究，经复旦大学附属儿科医院伦理委员会审核批准（批准号：2019-066），并获得患儿监护人知情同意。以2019年8—9月间在复旦大学附属儿科医院进行WGS检测的危重症患儿为研究对象，分析患儿临床特征、基因检测结果、结局转归。纳入标准：（1）在新生儿重症监护病房（neonatal intensive care unit，NICU）中怀疑为遗传因素致病的危重症新生儿（日龄≤28 d），出现肌力或肌张力异常、先天结构畸形、反复感染、血或尿串联质谱遗传代谢指标异常等；（2）进行了一家三口（患儿和其父母）的WGS检测。排除标准：（1）患儿已经获得产前基因诊断；（2）无法取得患儿监护人知情同意。

1.2 WGS的检测方法

抽取患儿及其父母外周静脉血各2 mL，采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）抽提基因组DNA。通过Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。患儿样本测序深度为40×~50×，测序数据量为120 Gb；患儿父母样本的测序深度为8×~10×，测序数据量为30 Gb。应用Illumina公司的Dynamic Read Analysis for GENomics Bio-IT（DRAGEN）平台对测序数据进行超快速分析。依据美国医学遗传学与基因组学学会评级标准对检测到的变异进行评级［8］。上述流程中，DNA提取和建库用时约12 h，基因组测序约42 h，测序数据处理及变异检测约19 h，测序数据解读约1 h。

1.3 临床资料收集

收集患儿性别、入院年龄、孕产次、出生体重、孕周、出生方式、入院主诉、主要症状等资料。通过门诊或电话随访患儿预后情况。

1.4 WGS的数据分析流程

针对危重症家系的WGS，采用快速反应流程，优化了从血样和临床信息采集到向临床医生报告候选致病变异的数据分析流程［9］。

全部流程包括：测序实验；原始数据快速生成；序列生成、变异格式转化和筛选；临床信息处理；候选变异解读。其中，测序实验包括血液样本编号和家系关系登记、DNA质控、测序上机、FastQ产出与质控。测序数据分析过程包括使用DRAGEN进行数据生成、快速变异检测、再次质控，校验性染色体，变异注释筛选，校验家系关系以辅助遗传模式分析。临床信息处理包括病史标准术语化处理和基于临床表型的候选基因分析。病史标准术语化处理包括基本的自然语言处理和现有的国际疾病分类（第10版）转化等，以将原始病历转化为人类表型术语（Human Phenotype Ontology）。临床表型分析以基于表型的候选基因优选为目标，主要采用PhenoPro算法，根据综合的标准化人类表型术语对可能的致病基因进行排序。最后，遗传诊断团队基于筛选的变异和患儿的表型，对变异的致病性进行综合评估。

2 结果

2.1 一般情况及临床特征

共纳入15例患儿，入院年龄为2 h至28 d，中位年龄为5 d，其中男9例 （60%），女6例（40%）；早产儿8例（53%），足月儿7例（47%）；剖宫产9例（60%），顺产6例（40%）。主要入院原因为呼吸异常7例（47%），反应差、喂养困难各2例（13%），发热、低体温、早产、抽搐各1例（7%）。详细临床特征见表1。

表1 15例患儿的基本临床特征、基因检测结果及临床转归

2.2 WGS检测结果分析

WGS平均检测周期为4.5 d，最短为72 h。3例患儿（患儿7、9、11）经WGS检测后获得基因诊断，诊断阳性率为20%（3/15）。

患儿7因早产生后气促呻吟入院，临床表型为肥厚型梗阻性心肌病、室间隔缺损、肺动脉高压，WGS检测到PTPN11基因存在错义变异c.1528C>G(p.Q510E)。PTPN11基因是常染色体显性遗传的Noonan综合征的致病基因。截至2022年12月，ClinVar数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）已有20余篇文献与该变异有关，并将其评为致病变异。本例患儿父母均未携带该变异，分析为新发变异，其心脏表现是典型的Noonan综合征心脏表型，结合临床与变异位点分析，该患儿诊断为Noonan综合征。患儿入院后反复出现经皮血氧饱和度波动，后因呼吸困难明显、血氧饱和度持续降低予以气管插管，气管插管加压下可维持血氧饱和度。患儿家属基于患儿病情及家庭经济情况，选择放弃治疗，拔管后患儿死亡。分析文献显示，该位点的多个病例均在数月内因严重心脏问题夭折［10-11］。

患儿9因生后2 d喂养困难入院，临床表现为皮-罗综合征，WGS检测到COL11A1基因存在剪接变异c.2295+1G>A，该变异位点未见报道，经Sanger验证，确认遗传自父亲（父亲自述表型正常，但未来院进行相关检查）。COL11A1基因变异可导致常染色体显性遗传病Stickler综合征II型。本例患儿下颌短小、舌根后坠、腭裂、隐匿性阴茎，符合该综合征表型。根据美国医学遗传学与基因组学学会评级依据［8］，该变异评为可疑致病变异（PVS1+PM2_S），该患儿诊断为Stickler综合征。本例患儿因舌根后坠及下颌短小导致呼吸困难，血氧饱和度不能维持。外科会诊后建议手术，家属拒绝并出院。最终患儿死亡。结合患儿病史及基因检测结果，推测该基因变异导致的畸形引起呼吸功能障碍是患儿的直接死亡原因。

患儿11因阵发性发绀半天入院，主要表型为中枢性呼吸衰竭，WGS检测到PHOX2B基因存在新发插入变异c.756_776dup(p.Ala254_Ala260dup)。PHOX2B基因是先天性中枢性低通气综合征的致病基因，呈常染色体显性遗传。ClinVar数据库记录有7篇文献报道该变异，评级为致病变异。既往文献［12］报道该病患儿需有创机械通气支持。本例患儿临床表现为中枢性呼吸衰竭，住院期间需呼吸机辅助呼吸，基因检测结果回报前，患儿家属已要求放弃治疗，后患儿死亡。

此外，在患儿8的CHD7基因编码区38号外显子上发现一个临床意义未明变异：c.8639C>T(p.Q510E)，变异位点遗传自母亲。

2.3 临床结局及转归

3例基因诊断阳性的患儿（患儿7、9、11）均死亡。携带临床意义未明变异的患儿8，因胎粪性腹膜炎行剖腹探查术，术中见全肠全坏死，患儿父母决定放弃治疗后患儿死亡。11例基因检测结果为阴性的患儿中，5例病情好转；3例患儿需呼吸机辅助通气，家属考虑患儿预后不良，放弃治疗；3例患儿随访结局死亡。

3 讨论

我们前期的数据显示，约20%（44/223）的NICU死亡患儿存在遗传致病因素［13］。早期基因诊断可协助临床医生改善危重症新生儿的管理策略。一些传统的遗传检测方法，如核型分析和基因芯片技术，难以检测单基因位点的变异。目前，国内已有多项研究［14-16］证实基因包测序和/或全外显子组测序技术具有很好的临床应用价值。但是，这些测序技术并不能全面覆盖整个基因组的变异情况。近年来，一些团队已经尝试将WGS用于危重症患儿的快速遗传性病因检测。一项纳入11篇文献的荟萃分析［5］结果表明，快速WGS技术在危重症婴儿中的综合诊断率为37%，说明快速WGS在危重症患儿的遗传性病因检测中具有良好的应用价值。

本研究检测15例患儿，其中3例获得基因诊断，诊断阳性率为20%，与国外的WGS诊断阳性率接近［17］。结合国内临床实际应用情况，本研究采用高性价比的测序方案，即对患儿样本使用测序深度为40×~50×，父母样本使用8×~10×的低覆盖测序，在确保有效检测效果的同时降低测序成本。常规高通量测序，因需要进行目标区域捕获建库，需要耗时3周以上，本研究中WGS检测，因不需要进行目标序列捕获，节省建库时间，平均检测周期仅为4.5 d，极大地缩短了检测时间。WGS检测数据量庞大，数据处理和变异解读是目前一个难点问题。本研究基于实验室已经开发的高通量测序数据一体化全流程分析系统［9］，根据不同变异类型的特点，按照单核苷酸变异和小插入/缺失，拷贝数变异、结构变异、非编码区域的变异注释、线粒体和杂合性缺失分别进行注释和筛选，将结果统一汇总至基因层面进行分析，便于数据解读人员结合受检患儿的临床表型，提升解读效率。当然，对于在WGS数据中发现的临床意义未明变异，仍需结合人工判读、病例表型随访进行致病性分析。

遗传性疾病的临床表型在新生儿期没有特异性，临床诊断困难，易错过最佳治疗时间。既往研究［6］显示，仅有10%的病例可根据典型的临床表型预测出最有可能导致疾病的基因。与既往报道［6］类似，本研究纳入的15例患儿入院主诉均不典型，主要表现为呼吸系统异常、反应差及喂养困难等常见的新生儿疾病临床症状。在明确诊断后，我们对基因诊断阳性患儿的表型与基因诊断阴性的患儿表型进行比较，无法获得较为特异性的表型，难以根据表型进行阳性诊断的预测。因此，采用快速WGS检测有利于尽早查明NICU患儿的病因，明确诊断，确定治疗方案并进行相应的遗传咨询。

目前NICU日均住院费用在2 000元以上，长时间的维持治疗给患儿家庭带来了沉重的经济负担，家属急迫需要知道具体的病因。有些遗传性疾病需要在生命早期尽快干预，而一些遗传性疾病在现有的医疗条件下缺乏有效治疗手段，只能进行姑息治疗。快速的基因检测的结果可以为病因诊断提供重要依据，辅助临床医生做出最佳的医疗决策，还有可能减轻患儿及其家庭的痛苦，避免无效努力。这其中需要遵循遗传咨询的相关伦理问题。在基因检测前，临床医生应详细地向患儿家属解释基因检测在病因诊断中的意义。获得基因检测结果后，临床医生应客观地告知患儿家属关于该疾病的知识，强调遗传性疾病在个体间存在的差异，科学引导患儿家属做出合理选择。

本研究尚有两点局限性值得探讨。首先，WGS数据量庞大，对生物信息学分析和临床解读要求非常高，需要配备相应的信息处理系统和生物信息分析团队，短期内难以在各医院推广应用；其次，WGS数据的变异解读基于对现有疾病知识的认知，一些患儿的数据可能在之后的数据更新中获得诊断，可能需要医生和家属配合提供进一步的临床随访信息，定期更新数据分析。

综上，WGS可为临床怀疑为遗传性疾病的危重症新生儿提供全面、快速、高性价比的遗传检测技术，缩短等待时间，为临床处置危重症病例提供诊断依据。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。