基于TLR4/NF-κB信号通路探讨脑络通颗粒对急性脑梗死模型大鼠的影响*

李亚军，李良勇，吴云虎，杨文明，2

1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031； 2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038

脑梗死是颅内动脉供血主干或穿支动脉突然中断血流，使其供血区域突然缺血缺氧，脑组织迅速坏死的一类疾病[1]，随着时间的推移出现相应区域的神经功能缺损，可表现为偏瘫、偏盲、偏深感觉异常以及头晕等症状，大血管闭塞可能使患者除以上表现外迅速进展为昏迷状态，严重危害人类的健康，是目前致残、致死率较高的疾病之一[2]，我国脑梗死的发病率较高且呈上升趋势[3]。目前，对时间窗内的脑梗死患者常使用药物静脉溶栓和大血管病变的机械取栓等治疗，但是能够从中获益的患者比较少[4]，所以药物保守治疗仍然是目前主要的治疗手段。药物保守治疗主要通过改善侧支循环，挽救缺血半暗带，同时通过脑细胞保护剂抑制凋亡神经细胞发生炎症反应，降低神经功能的进一步损害[5]。在急性期脑梗死发生发展过程中，炎症反应贯穿急性期的全过程，严重影响了患者的预后[6]。安徽中医药大学第一附属医院采用脑络通颗粒治疗急性脑梗死取得很好的临床疗效，但是对于该药临床使用机制缺乏客观依据。本文采用改良线栓法建立大脑中动脉闭塞导致的急性脑梗死大鼠模型探讨脑络通颗粒对急性脑梗死模型大鼠Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信号通路及其下游炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)的影响，挖掘脑络通颗粒治疗急性脑梗死的作用机制，为临床合理用药和新药开发奠定基础。

1 材料

1.1 动物15只SPF级雄性SD大鼠，体质量 180～220 g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，许可证号：SCXK(豫)2019-0002，合格证号：HXDW221936。大鼠饮用水为灭菌二级超纯水，质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的规定。饲养环境：温度范围20～25 ℃，相对湿度范围40%～70%。实验前大鼠在动物房环境中适应7 d。本实验经安徽中医药大学实验动物伦理委员会许可(动物伦理编号：AHUCM-rats-2022099)。

1.2 药物与试剂黄芪、当归、赤芍、川芎、葛根、石菖蒲、地龙、熟地黄(四川新绿色药业科技发展有限公司，颗粒剂，批号：21090158、21030075、20100193、21100182、21050052、21100234、21030065、20120074)。水合氯醛(美国Sigma公司，货号：23100)；大鼠CRP、TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附检测试剂盒[科鹿(武汉)生物科技有限公司，货号：ELK1055、ELK1396、ELK1272]；IKK-β抗体、MyD88抗体(江苏亲科生物研究中心，货号：AF6009、AF5195)；TLR4抗体、NF-κB P65抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)二抗、HRP标记的山羊抗大鼠IgG(H+L)二抗、超敏兔鼠通用二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：19811-1-AP、10745-1-AP、SA00001-2、SA00001-1、PR30009)；苏木素染液(杭州浩克生物科技有限公司，货号：HK1024)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(碧云天生物技术有限公司，货号：P0012、P0013、ST506)。

1.3 仪器眼科镊、精细剪、持针钳(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，货号：F12005-10、S18001-11、F31025-13)；全波长酶标仪(无锡华卫德朗仪器有限公司，型号：DR-200Bc)；水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司，型号：DK-98-IIA)；恒温箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9070A)；高速组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-II)；移液枪[大龙兴创实验仪器(北京)股份公司，型号：KE003068]；离心机(美国SCILOGEX公司，型号：CF1524R)。

2 方法

2.1 动物分组、模型建立及干预15只SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养7 d后，分为假手术组(n=8)和造模组(n=16)，除假手术组外，其余大鼠采用线栓法制备大脑中动脉局灶性脑缺血模型，按 10 mL·kg-1体积腹腔注射10%水合氯醛将大鼠麻醉后仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露颈总及颈内、外动脉，并在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉，颈外动脉剪口，插入头端烧成圆钝形且直径为 0.25 mm 的尼龙鱼线，进线长度18～19 mm，在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉，然后将颈外动脉连同尼龙鱼线一起结扎，缝合皮肤，单笼喂养，大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪、站立不稳，提尾时向一侧转圈即判定为模型成功，假手术组分离动脉后不插入鱼线。造模成功后将造模组大鼠随机分为模型组、脑络通组，每组8只，脑络通组大鼠给予脑络通混悬液，剂量为20.2 g·kg-1，假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水，连续给药14 d，每天1次。

2.2 大鼠神经功能评分参照Longa评分标准[7]，每天对大鼠进行神经功能评分，其标准如下：无任何神经功能损伤症状为0分；不能完全伸展对侧前爪为1分；向瘫痪侧转圈为2分；向对侧倾倒为3分；不能自发行走，意识丧失为4分。

2.3 TTC染色观察大鼠脑梗死体积大鼠神经功能测试后，禁食24 h称其质量，按10 mL·kg-1体积腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧固定在手术台上，取血后分离完整脑组织。脑组织标本置于干净的 50 mL 离心管中，立即置于-20 ℃冰箱保存，每组3只，30 min后取出切片，加入5 mL TTC染液，置于37 ℃烘箱中避光反应20～30 min，中间不时翻动脑切片，使染色充分，然后将脑切片放入PBS中浸泡 5 min，取出拍照。使用Image J软件对梗死面积进行分析。

2.4 ELISA实验取剩余5只大鼠的适量脑组织于预冷的PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.0～7.2)中清洗去除血液，称其质量后将组织剪碎放入专用的研磨仪离心管中，然后按140的质量体积比(gmL)加入PBS溶液，并加入适量的蛋白酶抑制剂，使用高速组织研磨仪60 HZ、180 s研磨1～3次，直至研磨充分。为了进一步裂解组织细胞，对样本反复冻融处理2次。最后将制备好的匀浆液于5 000 r·min-1离心10 min，取上清即可检测。根据ELISA试剂盒说明书的操作步骤检测大鼠血清与脑组织中CRP、TNF-α、IL-1β的水平。

2.5 Western Blot实验取剩余5只大鼠的部分脑组织，加入RIPA细胞裂解液，提取各组脑组织中总蛋白，加样，电泳、转膜；采用5%脱脂奶粉封闭 2 h。经过洗涤，加入一抗TLR4、NF-κB P65(稀释比例为1500)及IKK-β、MyD88(稀释比例为11 000)于4 ℃孵育过夜；加入按照110 000比例稀释后的二抗孵育2 h。经洗涤显影后拍照，保存图像，分析数据。

2.6 免疫荧光实验取剩余5只大鼠的部分脑组织，将脑组织样本置于4%多聚甲醛中固定48 h后，采用石蜡包埋，制备脑组织样本石蜡切片后行免疫荧光染色，将切片经脱蜡至水进行抗原修复，分别采用TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88荧光抗体进行 4 ℃ 孵育过夜，二抗室温孵育90 min后进行DAPI染色，最后滴加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片。于荧光显微镜下观察染色效果，显微镜镜检，图像采集分析。

3 结果

3.1 神经功能评分比较假手术组大鼠神经功能正常、无缺损，评分为0分。给药前，与假手术组比较，模型组及脑络通组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01)。给药后，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，脑络通组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠神经功能评分比较 分)

3.2 TTC染色结果TTC染色结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积显著增加(P<0.01)；与模型组比较，脑络通颗粒治疗14 d后，大鼠脑梗死体积明显缩小(P<0.05)。见图1。

注：A： TTC染色图片，红色为正常组织，白色为梗死组织；B：脑梗死体积半定量分析比较；n=3；与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

3.3 大鼠血清与脑组织中TNF-α、IL-1β、CRP水平比较与假手术组比较，模型组大鼠血清 TNF-α、IL-1β、CRP水平及脑组织TNF-α、IL-1β水平极显著升高(P<0.01)，脑组织CRP水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，脑络通组大鼠血清TNF-α水平及脑组织中IL-1β的水平极显著下降(P<0.01)，血清IL-1β、CRP水平及脑组织TNF-α、CRP水平显著下降(P<0.05)。见图2。

注：A：血清中TNF-α、IL-1β及CRP水平比较(n=8)；B：脑组织中TNF-α、IL-1β及CRP水平比较(n=5)；与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.4 免疫荧光结果比较DAPI将细胞核染成蓝色，Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Fluor594偶联抗体将目的蛋白染成红色。免疫荧光结果如图所示，与假手术组比较，模型组大鼠TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88阳性表达细胞数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，脑络通组大鼠TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88阳性表达细胞数显著下降(P<0.05)。见图3。

注：A：各组脑组织TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88免疫荧光染色图片；B：免疫荧光强度数据分析；与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05；n=5

3.5 脑组织TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表达水平比较与假手术组比较，模型组TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表达水平明显上调(P<0.01)；与模型组比较，脑络通组TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。见图4。

注：A：TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白条带图；B：TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表达水平比较；与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05；n=5

4 讨论

中医称脑梗死为“中风病”，自古以来就有大量的医案及文献报道证明尽早使用中医药干预治疗可以减轻神经功能缺损，促进神经功能恢复。中医认为中风主要是平素气血亏虚，心、肝、肾功能失调，加上情志不遂、饮食失节等因素导致阴阳失调，气血逆乱，上犯于脑，出现半身不遂，言语不清，甚至猝然昏仆等表现[8]。急性脑梗死发生后，缺血脑组织周围会迅速建立侧支循环，形成新生毛细血管起到代偿作用，减少脑细胞凋亡，但是缺血核心区域仍然会有大量脑细胞凋亡，产生自由基破坏周围脑组织。同时凋亡脑细胞发生炎症反应产生大量炎症因子，而这些炎症因子又会阻碍受损神经细胞的修复，加速神经功能缺损及延缓神经功能的恢复[9-10]，因此，脑梗死患者体内炎症反应对疾病的发生、发展具有重要意义[11]。TLR4是Toll受体家族成员，在免疫激活中起着重要作用，参与脑梗死后炎症反应，激活TLR4/NF-κB炎症通路，促进神经元炎性细胞因子和氧化应激的产生[12-13]。TLR4/NF-κB是比较经典的炎症通路，TLR4作为上游炎症调节因子，通过MyD88信号通路可以激活下游NF-κB，NF-κB是一种主要的氧化还原敏感性转录因子，可诱导多种促炎基因，调节炎症因子IL-1β、TNF-α和 IKK-β 等[14]。TLR4的异常表达可能引起异常的神经炎症反应，通过抑制TLR4介导的NF-κB通路的激活减少IL-1β、TNF-α和IKK-β等促炎因子释放，最终减少邻近神经元的损伤[15]。TNF-α和 IL-1β 是促炎细胞因子，作用于血管内皮细胞，可损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱，使血管损伤和血栓形成，促进动脉粥样硬化的发生和演变以及血栓性并发症的发展[16]。IKK-β激活是NF-κB信号通路的关键调节因子，与炎症的发生有关[17]。在促炎因子的调控下，CRP生成增加，而CRP是体内比较敏感的炎症标志物[18]。因此，TLR4/NF-κB炎症通路及下游炎症因子可参与脑组织损伤后炎症反应，抑制此炎症通路可能是神经保护的关键。

脑络通颗粒由安徽中医药大学第一附属医院脑病中心经多年诊治脑血管经验积累，在补阳还五汤的基础上化裁成方，方剂由黄芪20 g、当归10 g、赤芍 10 g、川芎6 g、葛根15 g、石菖蒲10 g、地龙10 g、熟地黄6 g组成，方中取黄芪大补元气，气旺血行，祛瘀不伤正，并助诸药之力，为君药；配以当归活血，有祛瘀而不伤好血之妙，是为臣药；赤芍、川芎、熟大黄、葛根助当归活血祛瘀，地龙通经活络，石菖蒲醒神，为佐使药；全药共用具有益气活血、 通络开窍之功，可用于气滞血瘀等证的治疗，而血瘀相关证型为急性缺血性脑卒中的主要证型[19]。现代药理学研究发现，黄芪、当归配伍可以一定程度上抑制TNF-α等炎症标志物的表达[20]。赤芍、川芎、葛根、石菖蒲、地龙、熟地黄等通过多靶点、多途径调节血管新生，同时可抑制白介素等炎症因子的表达[21-25]。从中医角度分析，脑络通颗粒组方具有益气活血，通络开窍之功[26]。现代药理研究表明脑络通颗粒具有抑制炎症反应，改善侧支循环发挥神经保护的作用[27]。

本实验通过对急性脑梗死模型大鼠TLR4/NF-κB炎症通路及其下游炎性因子的研究挖掘脑络通颗粒治疗急性脑梗死的作用机制，结果显示，脑络通组大鼠脑梗死体积明显小于模型组，神经功能评分低于模型组，说明脑络通颗粒可以减少模型大鼠的脑梗死体积，改善神经功能。结合大鼠血清与脑组织样本ELISA检测结果可以发现，脑络通组血清及脑组织中CRP、TNF-α、IL-1β水平明显下降，说明脑络通颗粒可能通过抑制脑组织损伤后的炎症反应减少梗死体积。免疫荧光及Western Blot检测发现，脑络通颗粒主要是通过降低TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表达水平抑制TLR4/NF-κB炎症通路，抑制炎症因子生成。

综上所述，脑络通颗粒通过降低TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表达水平，抑制TLR4/NF-κB 炎症通路激活，减少CRP、TNF-α、IL-1β生成，从而减少大鼠脑梗死体积，改善大鼠神经功能缺损。本研究为临床使用脑络通颗粒治疗急性脑梗死提供了理论基础，阐明了脑络通颗粒治疗急性脑梗死的作用机制。