黏液-纤毛标志物Mucin 5AC-acetylated alpha-tubulin在过敏性鼻炎患者鼻黏膜中的表达

郭沐涛， 周穗子， 邱前辉

过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是当机体接触过敏原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病，典型的临床症状包括鼻痒、打喷嚏、流鼻涕、眼痒和鼻塞[1]。如症状控制不佳不仅会增加哮喘的风险，还会降低学习、工作的效率，严重者还会引发睡眠质量不佳及情绪低落等问题[1-2]。鼻腔黏液-纤毛系统是上呼吸道的第一道防线，主要通过黏液分泌和纤毛摆动发挥清除功能。在正常呼吸过程中，空气中被吸入的病原体会刺激鼻腔上皮细胞分泌黏液，随后在鼻腔运动纤毛和黏液毯共同作用下将含有病原体的黏液排出，从而控制鼻腔炎症的发生和发展[3]。已有文献报道，鼻腔黏液-纤毛系统损伤是AR的重要病理现象，使过敏原和病原体在上呼吸道停留时间延长，加重AR症状及并发症的严重程度[4]。然而在AR中，黏液-纤毛系统哪些成分损伤，损伤的分子表现及严重程度与AR的发生发展关系尚不清楚。通过文献复习，Mucin 5AC(MUC5AC)在蛋白水平上定位在呼吸道上皮杯状细胞分泌黏液中最常见、最经典的标志物[5-6]。acetylated alpha-tubulin(acet. α-tubulin)是纤毛的微管结构的标志物，在蛋白水平上的表达水平直接反映了纤毛生长情况[7-8]。鉴此，本研究旨在通过检测黏液-纤毛系统的核心标志物来阐明AR患者黏液、纤毛在分子水平上的损伤表现，并进一步探究该系统的损伤与AR的发生发展关系，为改善AR症状的治疗提供研究基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2021年3月至2022年3月期间在我院进行鼻中隔偏曲手术的40例患者的下鼻甲黏膜组织。其中AR 21例(AR组)，男13例，女8例；年龄(31.76±9.44)岁；过敏源为尘螨17例，其他4例；纤毛染色阳性样本21例，黏液染色阳性样本21例。非AR患者(对照组)19例，男13例，女6例；年龄(39.58±12.50)岁；纤毛染色阳性样本19例，黏液染色阳性样本19例。AR的诊断参照国际变应性鼻炎及其对哮喘的影响(Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma,ARIA)指南的诊断标准[9]，并且根据皮肤点刺实验(Allergopharma,Reinbek,Germany)或血清敏筛过敏原检测系统(Mediwiss Analytic GmbH,Moers,Germany)的结果对AR进行诊断，排除哮喘病史，并且不伴有急慢性鼻窦炎症状者。本研究经南方医科大学附属广东省人民医院医学伦理委员会批准(伦理号：KY-Z-2021-397-01)。

1.2免疫荧光染色方法 术中取鼻腔下鼻甲组织样本，在室温下用4%多聚甲醛固定液固定24 h以上，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，烘干。常规脱蜡后置样本于95 ℃高温水浴修复10 min，自然冷却60 min。经过打孔、封闭之后，滴加一抗[鼠抗人acet. α-tubulin单克隆抗体，clone ab24610(Abcam,Cambridge,MA)]和兔抗人MUC5AC多克隆抗体[H160:sc20118(Santa Cruz Biotechology)]，两者的工作浓度都是1∶800，4 ℃孵育过夜。隔日漂洗后滴加二抗[荧光488-(抗鼠)和荧光594-(抗兔)，Life Technologies,Carlsbad,CA]。两者的工作浓度均为1∶500。最后滴加4′6-二氨基-2-苯基吲哚(4′6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行细胞核染色，封片。置于荧光显微镜(Olympus IX51,Tokyo,Japan)下观察，组织切片用400倍物镜拍摄。

1.3黏液分泌程度和纤毛长度、密度、脱落的评估方法 所有样本先不分组，在400倍物镜下单独、随机选取5个视野拍摄。由2个实验者用Image J软件分别进行评估。黏液用MUC5AC阳性染色进行评估[6]。纤毛用acet. α-tubulin阳性染色进行评估，指标包括纤毛密度和长度[3]、纤毛脱落[10]。(1)黏液分泌程度和纤毛密度：每个视野用对应标志物的总免疫荧光强度进行评估，取5个视野的荧光强度平均值为该样本的黏液分泌程度和纤毛密度。(2)纤毛长度：以20 μm(400倍物镜下的比例尺)作为测量的标准。每个视野测量20次，取5个视野的平均测量值为该样本的纤毛长度。(3)纤毛脱落：参看相关文献[11]，细胞标志物阳性染色的截断值设为70%。将>70%纤毛阳性染色的区域判定为纤毛完整，评为0分；≤70%纤毛阳性染色的区域判定为纤毛脱落，评为1分。5个视野评分的平均值为该样本的纤毛脱落程度。

1.4统计学方法 应用GraphPad Prism 7软件进行数据分析。非正态分布的计量资料以中位数(下四分位数，上四分位数)[M(P25，P75)]表示，对照组和AR组的纤毛和黏液的评估采用Mann-Whitney 2-tailed非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组黏液分泌情况比较 对照组和AR组患者的下鼻甲上皮黏膜组织中杯状细胞分泌黏液形态见图1。黏液的标志物(MUC5AC)成颗粒状分泌，形态、大小不固定，可存在于上皮杯状细胞层以上，甚至在黏液分泌较多情况下会黏附于纤毛表面。对照组的黏液分泌排列较稀疏，形态较小并表达黯淡；AR组的黏液分泌排列紧密，形态肥厚、表达明亮并黏附于纤毛表面，其分泌量明显高于对照组。对照组黏液分泌的总免疫荧光强度为2 536 685(1 643 296，5 059 862)，AR为3 750 531(2 263 503，6 435 619)。与对照组相比，AR组黏液分泌的总免疫荧光强度增加了32.365%。见图2。由此可得，AR患者的黏液分泌相比对照组显著增多(P<0.05)。

ⓐ对照组MUC5AC(黏液染色，比例尺为20 μm)；ⓑ对照组DAPI(细胞核染色)；ⓒ为ⓐⓑ图合并；ⓓAR组MUC5AC(黏液染色)；ⓔAR组DAPI(细胞核染色)；ⓕ为ⓓⓔ图合并

图2 对照组与AR组黏液分泌量比较图

2.2两组纤毛长度、脱落和密度情况比较 对照组和AR组的下鼻甲组织的纤毛形态见图3。与对照组相比，AR组纤毛较短小、稀疏且脱落明显，排列不整齐。对照组的纤毛长度为3.931(2.876，4.341)μm；AR组的纤毛长度为2.642(2.399，2.951)μm(见图4ⓐ)。与对照组相比，AR组的纤毛长度缩短了将近1/2，差异有统计学意义(P=0.000 1)(见图4ⓑ)。对照组纤毛脱落评分为0(0，0.2)分，AR组为0.33(0，0.55)分，AR组的得分上升了将近3倍，差异有统计学意义(P=0.032)(见图4ⓒ)。对照组和AR组纤毛的总免疫荧光强度分别为25 753(16 147，33 563)和19 429(13 530，27 560)，AR组纤毛的总免疫荧光强度相比对照组下降了24.555%(见图4ⓓ)。由此可得，AR患者的纤毛密度相比对照组降低。AR患者鼻上皮黏液-纤毛清除功能损伤模式见图5。

ⓐ对照组acet. α-tubulin(纤毛染色，比例尺为20 μm)；ⓑ对照组DAPI(细胞核染色)；ⓒ为ⓐⓑ图合并，箭头指代纤毛脱落；ⓓAR组acet. α-tubulin(纤毛染色)；ⓔAR组DAPI(细胞核染色)；ⓕ为ⓓⓔ图合并，箭头指代纤毛脱落

图4 对照组与AR组纤毛评估图

图5 AR患者鼻上皮黏液-纤毛清除功能损伤模式图

3 讨论

3.1黏液-纤毛清除功能是呼吸道固有免疫的重要组成部分，它由黏液、气道表面液体、纤毛细胞表面的纤毛构成[12]。黏液-纤毛清除系统通过分泌黏液捕获入侵的过敏原和病原体，分泌炎症介质和免疫细胞募集的趋化因子，再通过有效的纤毛摆动将包裹在黏液层的有害物质排出呼吸道[13-15]。在健康人体中，正常的黏液-纤毛系统可以有效保护上下呼吸道，维持呼吸道的自净功能，减少抗原刺激和疾病感染的风险[16-17]。然而，在AR患者中，黏液-纤毛清除功能损伤会增加过敏原的停留时间，加重鼻腔黏膜的炎症浸润状态，加重AR的症状，甚至导致哮喘等一系列过敏性疾病，降低患者的生活质量。

3.2临床上评价黏液-纤毛清除功能主要通过糖精清除试验来检测。本文主要研究AR分子水平的损伤表达。acet. α-tubulin是纤毛细胞的微管结构的标志物，它表达在纤毛细胞顶端，与纤毛生长位置重合。Shah等[18]2009年发表在Science的研究中把acet. α-tubulin作为气道上皮纤毛标志物。Kanamaru等[19]及Wang等[20]在2022年的研究报道中也沿用acet. α-tubulin作为纤毛运动的标志物。MUC5AC是在气道上皮中表达的主要分泌黏蛋白，它在N端和C端具有富含半胱氨酸结构域的糖蛋白，可通过二硫键聚合。Song等[21]研究发现，MUC5AC缺失会导致黏液纤毛运输受损和不协调，进一步说明这种黏蛋白对气道清除的重要性。Jiang等[22]报道了在AR小鼠模型及白细胞介素13(interleukin 13,IL-13)刺激体外分离的鼻上皮细胞中MUC5AC的表达上调。Wang等[23]采用低覆盖率全基因组测序方法对汉族后裔AR患者的病例及其父母3人进行了检测，结果发现MUC5AC拷贝数与AR易感性相关。而Peng等[24]通过基因芯片测序方法发现，相比对照组患者，AR患者鼻黏膜中纤毛基因表达广泛下调，纤毛脱落增加，但纤毛长度是否改变尚未被报道。本研究直接取AR组和对照组患者的鼻黏膜样本，进一步分析黏液蛋白MUC5AC、纤毛基因acet. α-tubulin的表达情况及纤毛长度的变化，为后续探究AR黏液-纤毛功能损伤提供分子基础。黏液-纤毛清除功能损伤是AR的重要病理现象。Song等[25]的研究结果表明，成年人AR症状综合评分越高，症状越重，鼻腔黏液-纤毛清除时间也相对延长。Mikolajczyk等[26]在儿童患者的研究中发现，黏液-纤毛清除时间与AR的严重程度以及鼻甲黏膜的嗜酸性细胞浸润程度呈正相关。这些研究结果在宏观上共同说明，AR病情越严重，黏液-纤毛清除功能损伤程度可能越高，清除病原体和过敏原所需的时间越长。本研究结果进一步提示黏液-纤毛清除功能损伤可能由黏液的分泌量显著增加，纤毛长度变短、排列不齐、稀疏以及脱落增加引起。本研究结果首次从分子水平上揭示了AR患者鼻腔的黏液-纤毛系统功能成分损伤的具体变化及严重程度，为进一步探索黏液-纤毛清除功能损伤在AR发病的分子机制及作用的基因靶点提供研究基础。

3.3越来越多的研究证据支持黏液-纤毛清除功能损伤是在发病机制上引起肺部慢性炎症性疾病的重要因素。有学者在气道上皮NA+通道过表达的小鼠模型上验证了NA+通道过度开放、气道表面脱水可能是气道黏液分泌过多导致黏液-纤毛清除功能受损，继而引起早期过敏性哮喘等2型过敏性疾病的病理生理机制[27-29]。还有研究认为，即使在没有细菌感染情况下，气道黏液分泌过多也可能会通过上皮缺氧坏死、潜在免疫调节作用等机制引起黏液-纤毛系统受损，触发慢性气道炎症和肺部损伤的发生[30-31]。另外，Lam等[32]发现自噬依赖途径可能与慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)中肺纤毛长度缩短、黏液-纤毛清除功能受损有密切关系，该作用途径有望成为COPD治疗的新靶点。有研究证实香烟烟雾会直接影响呼吸道纤毛长度，从而降低气道的黏液-纤毛清除的能力，为长期吸烟导致COPD的发病提供了重要的实验依据[33-35]。本研究结果显示鼻腔黏膜的黏液分泌过多及纤毛结构破坏导致黏液-纤毛清除功能损伤也可能是参与AR发病的重要原因，但其中的发病机制目前尚不清楚。这将为我们未来深入研究黏液-纤毛功能损伤在AR等常见呼吸道疾病的发病机制中提供实验依据及方向指引。

3.4Di Berardino等[36]的临床研究表明，通过鼻腔冲洗来加强鼻腔黏液-纤毛清除功能的治疗方法能有效缓解AR的症状。Mall和Galietta[37]在小鼠模型上验证了使用NA+通道抑制药物(阿米洛利特)可改善气道表面水化和加速黏液排出，提高呼吸道的自净能力，缓解过敏原刺激引起的气道反应，如气道嗜酸性细胞浸润、IL-13分泌和气道高反应性。由此可见，改善鼻腔黏液-纤毛清除功能可以有效缓解AR的症状。恢复黏液-纤毛清除功能可能为AR患者，甚至哮喘等过敏性疾病患者群体提供潜在的治疗机会。

3.5尽管我们已经在AR患者下鼻甲黏膜组织发现了黏液分泌增加和纤毛结构异常可能是导致AR黏液-纤毛清除功能损伤的直接原因，但个体差异是不可避免的。同时，样本量不足也可能是导致黏液和纤毛总免疫荧光强度未达到统计学意义的限制因素，但其表达上调及下调的趋势与相关文献报道的数据具有一致性，因此认为其表达趋势变化是真实可信的。基于此研究基础，我们将用人鼻上皮干细胞模型以及动物实验来验证这一结论，并延续性探究黏液-纤毛系统损伤导致AR的发病机制，为临床上AR诊断及治疗策略提供新颖、有效和安全的理论依据。

综上所述，本研究从分子水平上揭示了AR黏液的分泌量增加，纤毛排列不齐、变短、稀疏以及脱落增加，是导致AR患者鼻腔黏膜黏液-纤毛清除功能减弱，继而加重AR症状严重程度的分子依据。根据文献复习，黏液-纤毛系统的损伤可能是AR发病的重要原因。改善黏液-纤毛清除功能的治疗有助于改善AR的症状严重性，可能为AR等过敏性疾病患者提供潜在的治疗机会。