冠突散囊菌发酵鲜桑叶对其黄酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响

刘瑾如，邱卫华

（1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190；2.中国农业大学工学院农业工程系，北京 100083）

近年来，全球范围内糖尿病的发病率逐年增高，预计到2045年，全球将会有近七亿糖尿病患者[1]。我国的糖尿病患者人数居世界首位，其中90%～95%为II型糖尿病[2-4]。α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过抑制糖苷酶活性降低和延缓餐后血糖的上升，并且能有效延缓糖尿病前期患者向II型糖尿病的发展[5]。目前临床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物主要是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等。但是这些药物普遍会产生一些副作用，如低血糖、水肿、乳酸中毒、胃肠道不耐受，甚至对肝脏的不良影响等[6-7]。因此，开发新型多靶点、安全价廉、高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为研究的热点[8]。

桑叶在我国分布广泛，含有黄酮类、生物碱类、多糖类、氨基酸类等多种生物活性物质，是典型的药食两用资源[9-10]。作为桑叶的主要功能成分之一，黄酮类物质是桑叶发挥降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老等作用的主要成分[11-13]。近年来，国内外开展了大量桑叶黄酮（mulberry leaf flavonoids，MLF）对 II型糖尿病治疗作用的研究，并发现MLF具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、降低胰岛素抵抗、增加葡萄糖消耗和骨骼肌线粒体功能等作用[14-17]。因此，MLF在糖尿病治疗中具有广阔的应用前景。但是，现有桑叶的研究大都是基于干制品开展的。在干燥过程中，黄酮等热敏性活性物质的含量和活性都会有不同程度损失。多部医药古籍中也有关于“生者优良”的观点，即在新鲜状态下可以更好地保持植物中活性成分的活性和功效[18-19]。因此，开展新鲜桑叶的相关研究有助于拓宽桑叶的应用前景。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）亦称之为“金花”，是属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种无毒且安全的益生真菌，已被广泛应用于福砖黑茶[20]、沙棘叶[21]、红豆[22]等的生物和风味化合物的形成或转化中。据报道它在植物的发酵过程中可分泌包括α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶等多种酶。这些酶不仅可以促进原料中易发酵物质的降解，增加植物中活性成分的含量，还可以改善活性成分的功能[23-24]。目前已有许多关于冠突散囊菌发酵提高原料中总黄酮含量的报道，包括桑叶、银杏叶、葛根、黑豆等[24-27]。因此，本文以自行筛选得到的冠突散囊菌E.cristatum CY-1进行鲜桑叶的固态发酵，研究了发酵对桑叶黄酮的含量及其对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响，以期达到通过微生物发酵实现桑叶中黄酮物质的富集，并提高其抗血糖功效的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冠突散囊菌E.cristatum CY-1：中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室自行筛选得到；鲜桑叶：市售；α-葡萄糖苷酶（酵母来源）、芦丁标准品（纯度≥98%）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，纯度≥99%）、氨基葡萄糖标准溶液（纯度≥99%）：上海源叶生物科技有限公司；二硝基水杨酸、乙酰丙酮、对二氨基苯甲醛、亚硝酸钠、硝酸铝、NaOH、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MB-96B型酶标分析仪：苏州聘怀科技有限公司；H2050R-1型高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；754PC型紫外-可见分光光度计：上海菁华科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌E.cristatum CY-1的固态发酵

土豆汁-葡萄糖液体（potato dextrose broth，PDB）培养基的制备：称取200 g马铃薯，去皮切碎，加水煮20 min后，纱布过滤取土豆汁，加入20 g葡萄糖，定容至1 000 mL，121℃灭菌20 min，冷却后备用。

E.cristatum CY-1种子液的制备：接种E.cristatum CY-1孢子于无菌的土豆汁-葡萄糖液体培养基中，在28℃～30℃以 180 r/min～200 r/min振荡培养 2 d～3 d，得到冠突散囊菌种子液。

桑叶发酵培养基的制备：称取洗净沥干水分的鲜桑叶500 g，分批加入到植物搅碎机中，加入适量蒸馏水进行搅碎，最终蒸馏水的加入体积为100 mL。收集搅碎后的鲜桑叶。按照与鲜桑叶质量比1∶10加入麸皮，自然pH值下搅拌均匀，得到桑叶固态发酵培养基。在250 mL三角瓶中加入上述30 g桑叶固态发酵培养基质，于121℃灭菌20 min后，冷却，用于E.cristatum CY-1的固态发酵。以10%接种量接种E.cristatum CY-1种子液，搅拌均匀后，置于28℃～30℃培养箱中静置培养。每2 d取样，样品置于4℃冰箱冷藏备用。每组试验设置3个平行。

1.3.2 冠突散囊菌生物量的测定

桑叶固态发酵基质中冠突散囊菌生物量的测定采用氨基葡萄糖法[28]。首先在520 nm测定氨基葡萄糖标准品含量与吸光度的关系，并建立其标准曲线。以E.cristatum CY-1纯菌体进行氨基葡萄糖的提取，在520 nm测定该提取液的吸光度，根据上述氨基葡萄糖标准品含量与吸光度的标准曲线得出提取液中所含氨基葡萄糖的量，并建立E.cristatum CY-1中氨基葡萄糖含量与其生物量的标准曲线。经E.cristatum CY-1固态发酵的桑叶培养物在60℃烘干至恒重后用于氨基葡萄糖的提取与测定，根据标准曲线方程（1）计算提取液中氨基葡萄糖含量，再根据标准曲线方程（2）换算得到发酵基质中E.cristatum CY-1的生物量。

式中：Y0为提取液中氨基葡萄糖的含量，mg；X0为提取液中氨基葡萄糖的吸光度；Y1为换算得到的菌体生物量，mg。

E.cristatum CY-1纯菌体的制备方法：将E.cristatum CY-1接种至土豆汁-葡萄糖液体培养基，在28℃～30℃以180 r/min～200 r/min振荡培养7 d。以纱布过滤发酵产物，并以蒸馏水充分洗涤，收集固体剩余物，烘干至恒重即得E.cristatum CY-1纯菌体。

1.3.3 冠突散囊菌发酵过程中桑叶基质失重率分析

取适量经E.cristatum CY-1固态发酵的剩余物，在60℃干燥至恒重后，按式（3）计算其含水率（%）。然后按式（4）计算发酵前后桑叶基质的失重率。

式中：R1和R2分别为发酵剩余物干燥前与干燥后的质量，g。

式中：W0和Wt分别为发酵前鲜桑叶基质和不同发酵时间桑叶基质的质量，g；R0和Rt分别为发酵前鲜桑叶基质和不同发酵时间桑叶基质的含水率，%。

1.3.4 桑叶总黄酮与总多糖的提取及其含量的测定

桑叶总多糖的提取及测定[29]：称取发酵前后的桑叶样品（湿重），按照料液比 1∶30（g/mL）加入蒸馏水，混匀后于80℃水浴超声辅助提取20 min，抽滤收集桑叶总多糖提取液。该多糖提取液以6 mol/L盐酸于沸水浴中水解30 min，冷却后调节pH值至8.0，得到桑叶多糖水解液。以葡萄糖为标准品，采用二硝基水杨酸法测定该水解液中还原糖含量（mg/g干桑叶）。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，故在计算单糖含量时需乘以0.9计算桑叶中总多糖含量。

桑叶总黄酮的提取及测定[30]：称取发酵前后的桑叶样品（湿重），按照料液比1∶10（g/mL）加入70%的乙醇溶液，50℃水浴超声辅助提取40 min，8 000 r/min离心10 min，收集上清液。沉淀物再按上述步骤重复提取1次，合并上清液，即得桑叶总黄酮提取液。以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-NaOH比色法于510 nm处测定吸光度，根据标准曲线方程Y=13.09X-0.057 7（R2=0.991 3）计算桑叶黄酮提取液中总黄酮含量（mg/g干桑叶）。

1.3.5 ɑ-葡萄糖苷酶抑制率分析

桑叶黄酮对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率分析在96孔板上进行[31-32]。共设置4个组别：空白组、对照组、样品空白组、样品组。其中，对照组为ɑ-葡萄糖苷酶与底物pNPG反应组；样品组中加入以pH6.8磷酸缓冲液（0.2 mol/L）稀释至0.001 mg/mL～0.040 mg/mL的桑叶黄酮提取物作为抑制剂。每个试验组所加入的试剂及添加顺序如表1所示。在反应结束时，加入1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，然后于405 nm波长下，以酶标分析仪测定吸光度。

表1 不同试验组中各反应物添加量和顺序Table 1 The adding volume and order of reagents in different experimental group μL

根据试验结果，按式（5）计算抑制剂对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率。并对经E.cristatumCY-1固态发酵4、8d和10d所得的桑叶的黄酮提取物进行浓度（0.001 mg/mL～0.040 mg/mL）与ɑ-葡萄糖苷酶抑制率（%）的非线性拟合，根据拟合曲线计算半抑制剂浓度（IC50）。

式中：AB为pNPG自动分解得到的吸光度；AC为pNPG自动分解和酶促分解得到的吸光度和；ASB为样品和pNPG自动分解得到的吸光度和；AS为样品、pNPG自动分解、酶促分解及抑制剂抑制分解所得到的吸光度总和。

1.4 数据统计分析

所有结果数据都设立至少3个平行组。采用Origin 9.0进行数据处理及图形绘制。采用One-way ANOVA进行数据的统计学分析，在95%置信区间被认为具有统计学意义（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 E.cristatum CY-1桑叶固态发酵的细胞生长及桑叶基质失重率

采用E.cristatum CY-1进行桑叶固态发酵，发酵过程中E.cristatum CY-1的细胞生长及桑叶基质的失重率见图1。

图1 以鲜桑叶为基质的冠突散囊菌细胞生长曲线及桑叶基质失重率Fig.1 The cell growth curve of E.cristatum CY-1 using mulberry leaves as substrate and the weight loss of mulberry leaf medium

由图1可知，就细胞生长而言，以ML固态发酵细胞干重随着发酵时间的延长而增加，且生长情况要优于以PDB液态发酵。在E.cristatum CY-1固态发酵桑叶基质的第8天，生物量达到最高值，为378.2 mg，之后生长趋于稳定。而随着E.cristatum CY-1的生长，桑叶培养基的失重率也增加，在发酵进行到第8天时，桑叶培养基的失重率达到19.64%，之后趋于稳定，这和E.cristatum CY-1的生长曲线趋势是一致的。

2.2 发酵过程中桑叶总黄酮含量的变化

桑叶总黄酮含量随E.cristatum CY-1发酵的变化见图2。

图2 桑叶总黄酮含量随E.cristatum CY-1发酵的变化Fig.2 The total flavonoids content in mulberry leaves during the fermentation of E.cristatum CY-1

通过研究E.cristatum CY-1固态发酵对桑叶总黄酮含量的影响发现，发酵后桑叶总黄酮的含量随着发酵时间的延长而不断增加，在第8天达到峰值3.289mg/g干桑叶，相对于未经发酵桑叶中总黄酮的含量提高了78.72%（图2）。总黄酮含量的升高主要归因于冠突散囊菌发酵过程中分泌的多种酶，如苯丙氨酸解氨酶、纤维素酶等均可破坏细胞壁的致密结构、降低细胞壁对黄酮类化合物溶出的阻滞作用，从而增加了总黄酮类物质的含量[27]。另一方面，通过分析发酵基质中总多糖含量的变化发现，虽然在发酵0～2 d，总多糖含量出现短暂的升高，但此后，随着发酵的进行总多糖含量快速降低，在第10天时基质中的总多糖含量由第2天的165.71 mg/g干桑叶降低至39.44 mg/g干桑叶，降解率达到79.52%。这说明基质中易发酵的多糖类物质作为营养源被E.cristatum CY-1用于维持生长与代谢。而随着多糖等物质的降解，发酵剩余物中黄酮类物质的相对含量显著提高[27，33]。另外，发酵过程中微生物可能通过生物转化促进黄酮类物质的生成，如申春莉等[34]发现在灵芝菌发酵豆渣的发酵前期，豆渣中的糖苷型异黄酮转化为苷元型异黄酮，这也可能造成发酵桑叶中黄酮类物质含量升高。

但是，发酵8 d后桑叶发酵剩余物中总黄酮含量迅速降低，在发酵第10天黄酮含量降至1.725 mg/g干桑叶，相对于第8天减少了约47.6%。造成发酵桑叶中总黄酮含量减少的原因，一方面是由于微生物发酵过程中分泌的次级代谢产物可与黄酮类化合物发生反应，导致黄酮类化合物的减少[34]。另一方面，在发酵后期，随着可发酵营养物质的消耗，黄酮类化合物可被微生物分泌的酶降解，并作为营养基质参与微生物的生长及代谢，从而造成黄酮含量的降低[33]。

2.3 发酵对桑叶中总黄酮α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

许多研究发现E.cristatum具有提高底物营养价值和生物活性的巨大潜力，如E.cristatum可以增强黑豆发酵过程中酚类化合物积累的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[24]，E.cristatum发酵葛根的抗氧化活性优于未发酵葛根[27]；E.cristatum发酵的豆渣提取物可作为潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂，并可以明显降低餐后血糖水平[35]。通过体外试验评价，研究了不同发酵时间所得到的MLF的α-葡萄糖苷酶抑制活性差异，结果见图3。

图3 E.cristatum CY-1发酵的桑叶黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.3 The inhibition efficiency of α-glucosidase of flavonoids extracted from the fermented mulberry leaf of E.cristatum CY-1

由图3可以看出，发酵后的MLF对α-葡萄糖苷酶的抑制率均明显升高，当MLF浓度约为50 μg/mL时，未经发酵桑叶的MLF对α-葡萄糖苷酶的抑制率为66.76%，而发酵10 d的桑叶MLF对α-葡萄糖苷酶的抑制率则达到90.54%。

对不同发酵时间所得MLF浓度与ɑ-葡萄糖苷酶抑制率进行拟合，结果表明ExpDec1模型的拟合效果较好，其拟合方程及R2见表2。

表2 发酵桑叶的黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率拟合参数Table 2 Fitting parameters of inhibition rate of flavonids extracted from fermented mulberry leaves on the α-glucosidase

发酵后的MLF对ɑ-葡萄糖苷酶的IC50均发生了明显的降低，且发酵时间越长，IC50值越低，其中经E.cristatum CY-1发酵10 d的桑叶黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶的IC50由未发酵MLF的25.955 μg/mL降至4.925 μg/mL。这说明E.cristatum CY-1发酵可以有效地改善MLF对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。虽然E.cristatum CY-1发酵桑叶在第10天时MLF（10）含量相对于发酵第8天的MLF（8）最高值减少了47.6%，但是它对α-葡萄糖苷酶的IC50值为11.670 μg/mL，明显高于MLF（10）。这可能是在发酵后期，微生物及其酶的作用使得黄酮类物质分解形成了新的结构及产物，而后者具有更强的α-葡萄糖苷酶的抑制能力[33-34]。

3 结论

论文研究了冠突散囊菌E.cristatum CY-1固态发酵对新鲜桑叶中总黄酮含量及其α-葡萄糖苷酶的抑制活性等的影响，取得了如下主要结论：E.cristatum CY-1能够以新鲜桑叶为发酵基质进行生长，并在发酵第8天趋于稳定，发酵30 g鲜桑叶E.cristatum CY-1的生物量达到378.2 mg。发酵过程中，桑叶的总黄酮含量呈现先升高后降低的趋势，在第8天桑叶黄酮含量相对于未发酵桑叶提高了78.72%，但之后明显降低。经E.cristatum CY-1发酵后的桑叶，其黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率随发酵时间的延长而不断升高，半抑制浓度（IC50）则明显降低。发酵10 d的桑叶，其黄酮提取物和未发酵桑叶的黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶的 IC50值分别为 4.925 μg/mL 和 25.995 μg/mL。由此可见，冠突散囊菌发酵可以有效地增强桑叶黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。