4种大型褐藻类菌胞素氨基酸的提取工艺优化及鉴定

朱文轩，钱亮亮，程同杰，胡志娟，唐倩，韩秀，孙颖颖*

（1.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；2.连云港市质量技术综合检验检测中心，江苏 连云港 222005）

类菌孢素氨基酸（mycosporine-like amino acids，MAAs）是以氨基环己烯酮或氨基环己烯胺为其骨架的环状结构，通过不同种类的氨基酸缩合而成[1]。MAAs广泛存在于藻类、浮游植物及微生物中[2]，在310 nm～360 nm的紫外光区具有强的吸收特性[3-4]。研究表明，MAAs还具有抗氧化等多种生理活性[1，4-5]。

大型海藻是MAAs的理想来源之一，已引起研究者们的广泛关注[6-9]。研究表明，MAAs存在于所有大型红藻和大型褐藻中[10]。目前，大型海藻MAAs研究多集中在MAAs的分布[11-14]、活性[15-17]以及环境因子对其积累和诱导[4，9，13]等其它[4，11，18，19]方面。已有的 MAAs 提取和分离纯化研究主要集中在 Bangia atropurpurea[5]、Bostrychia scorpioides[7]、Nostoc flagelliforme[20]、海 萝（Gloiopeltis furcata）[21-22]、江 蓠（Gracilaria chilensis）[23]、坛紫菜（Porphyra haitanensis）[24]、紫菜（Porphyra sp.）[25]等大型红藻中，而国内外大型褐藻MAAs研究很少。本实验室前期研究指出，570多种含有MAAs的大型海藻中大型褐藻数量不超过50种[11]。目前，仅在Desmarestia menziesii[12]、Padina crassa[12]和其他大型褐藻[13]中发现了MAAs，很多大型褐藻MAAs并未被探明。此外，除了 shinorine、porphyra-334、palythine、palythinol、asterina-330和mycosporine-glycine等常见MAAs外，大型褐藻还含有很多未知MAAs[10-15]。因此，非常有必要对大型褐藻MAAs开展研究，以填补国内外相应领域的研究空白，并可能获得新的MAAs。

基于上述，选定羊栖菜（Hizikia fusifarme）、海带（Laminaria japonica）、马尾藻（Sargassum sp.）和裙带菜（Undaria pinnatifida）4种大型褐藻，通过单因素和正交试验，研究液料比、提取时间、次数和温度对MAAs得率的影响，获得4种大型褐藻MAAs适宜提取工艺。进一步，采用紫外波长扫描、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和质谱（mass spectrum，MS）测定，并参照已有文献报道，鉴定它们中的 MAAs，即 palythine、palythenic acid、porphyra-334 和shinorine。其中，palythenic acid目前仅在大型红藻Solieria chordalis中发现[26]，该类菌胞素氨基酸单体化合物（mycosporine-like amino acid，MAA）在浮游植物和微藻中较为常见。目前，国内外尚未见马尾藻提取工艺和4种大型褐藻MAAs鉴定研究，本文为大型褐藻MAAs的研究提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊栖菜、海带、马尾藻、裙带菜：江苏碧蓝海洋生物科技有限公司，经清洗、冷冻干燥、粉碎后，备用。

甲醇、甲酸（色谱纯）：北京迪科马科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硅胶板：青岛海洋化工厂分厂；碘化铋钾：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Cubis II电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DXF-4D摇摆式粉碎机：广州大祥电子机械设备有限公司；FL-12770风冷商用冷柜：博兴县爱德信商用厨具有限公司；BUCHIR R210旋转蒸发仪：瑞士BUCHIR公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：临海市永昊真空设备有限公司；Millipore MIlli-Q超纯水系统：美国密理博公司；DKZ-2电热恒温振荡水槽：上海精宏实验设备有限公司；LGJ-10FD冷冻干燥机：北京松源华兴生物技术有限公司；T9CS双光束紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；1260高效液相色谱仪、Eclipse Plus C18色谱柱：美国安捷伦科技公司；HS-F1613台式超速冷冻离心机、TSQ Quantum Access型液质联用仪：赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 大型褐藻MAAs的提取

称取大型褐藻干粉末10 g，加入250 mL浓度25%的甲醇水溶液，45℃振荡提取2 h，以8 000 r/min常温离心20 min。重新加入相同体积的25%甲醇溶液，按照上述条件重复浸提1次～2次。上清液合并、减压蒸发后（除去甲醇），加入4倍体积无水乙醇，放在-18℃冰箱中静置6 h。低温离心20 min或直接抽滤，上清液或滤液40℃下减压蒸发，浓缩液冷冻干燥，即得MAAs提取物。MAAs得率按以下公式进行计算。

式中：R为MAAs得率，%；m1为初始提取的MAAs质量，g；m2为大型褐藻干粉末质量，g。

根据文献报道的MAAs摩尔消光系数ε[2]及计算方法[5]，得到4种大型褐藻MAAs提取物中MAA含量的计算公式如下。

式中：X为MAA含量，mg；A为特征吸收波长下的吸光度；M 为分子质量（shinorine，332；palythine，244；porphyra-334，346；palythenic acid，328）；ε 为 MAAs摩尔消光系数 （shinorine，43 700；palythine，35 500；porphyra-334，42 300；palythenic acid，29 200）。

1.3.2 单因素试验

在提取过程中，根据表1设定的因素水平，依次分析液料比、提取时间、提取温度和提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响，每个试验设定3个平行样。在考察提取温度单因素试验中，提取时间、提取次数和液料比设定为2 h、2次和20 mL/g；在考察液料比单因素试验中，提取温度、提取时间和提取次数设定为45℃、2h和2次；在考察提取时间单因素试验中，提取温度、提取次数和液料比设定为45℃、2次和20 mL/g；在考察提取次数单因素试验中，提取温度、提取时间和液料比设定为和液料比设定为45℃、2 h和20 mL/g。单因素试验因素与水平见表1。

表1 单因素试验因素与水平Table 1 Factors and levels of single factor tests

1.3.3 正交试验

根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验设计，以MAAs得率为指标，进一步分析提取温度（A）、液料比（B）和提取时间（C）3个因素对4种大型褐藻MAAs提取的影响（因素水平见表2），试验过程中不设定平行样。

表2 正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.4 MAAs检测

1.3.4.1 紫外波长扫描

称取大型褐藻MAAs提取物0.1 g溶解于1 mL水中，经0.45 μm水系滤膜过滤后，在紫外-可见分光光度计进行200 nm～400 nm波长扫描，确定MAAs提取物特征吸收峰。

1.3.4.2 硅胶薄层层次（silica gel thin layer chromatography，TLC）检测

称取大型褐藻MAAs提取物0.1 g，溶解于1 mL 25%甲醇溶液中（浓度均为0.1 g/mL），在硅胶G板上点样，以甲醇∶乙醇∶水（8∶10∶0.5，体积比）为展开剂。展开结束后，吹干G板，喷洒碘化铋钾溶液（7.3 g碘化铋钾，冰醋酸10 mL，蒸馏水60 mL）、静置，橙色或黄色斑点为MAAs阳性反应。

1.3.4.3 高效液相色谱法测定

检测器设置波长范围190 nm～400 nm，色谱柱选用 Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流动相:A为0.2%甲酸-水；B为乙腈，梯度设置如表3所示；流速1.0 mL/min、柱温25℃、波长330 nm、进样量 50 μL。

表3 流动相洗脱梯度Table 3 Mobile phase elution gradient

1.3.4.4 质谱测定

喷雾气压310 kPa，氮气流速10.0 L/min，干燥温度350℃，破碎电压100 V，毛细管电压4 500 V，全扫描，参比离子质荷比：121.050 9，922.009 8，为参比离子对测定结果进行实时矫正，分辨率m/z在922.009 8处为11 300 全扫描，质荷比（m/z）为 120～100 0。

1.4 数据处理

利用SPSS 25分别对单因素和正交试验结果进行显著性和方差分析，采用Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 大型褐藻MAAs提取工艺

2.1.1 单因素试验结果

2.1.1.1 液料比对4种大型褐藻MAAs得率的影响

液料比对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图1。

图1 液料比对4种大型褐藻MAAs得率的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

由图1可知，随液料比增加，整体上4种大型褐藻MAAs得率增大。在液料比为20mL/g或25mL/g时达到最大值，此时得率显著（P＜0.05）高于液料比为10 mL/g时所制备MAAs的得率，这表明，较大的液料比有利于大型褐藻MAAs的提取。当液料比继续增加时，4种大型褐藻MAAs得率并未发生明显变化。

2.1.1.2 提取时间对4种大型褐藻MAAs得率的影响

提取时间对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图2。

图2 提取时间对4种大型褐藻MAAs得率的影响Fig.2 Effects of extraction time on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

由图2可知，4种大型褐藻MAAs得率随提取时间的延长呈现先明显增加后略微下降的趋势。在提取时间为3 h时，马尾藻MAAs得率最大；其它3种大型褐藻MAAs得率在提取时间为2 h时达到最大。

2.1.1.3 提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响

提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图3。

图3 提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响Fig.3 Effects of extraction times on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

由图3可知，整体来看，随提取次数的增加，4种大型褐藻MAAs得率增加，在提取次数为2次时所得到的MAAs得率较大，表明较多的提取次数，利于4种大型褐藻MAAs的提取。当提取次数继续增加时，4种大型褐藻MAAs得率并未出现明显增加。

2.1.1.4 提取温度对4种大型褐藻MAAs得率的影响

提取温度对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图4。

图4 提取温度对4种大型褐藻MAAs得率的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

从图4可知，4种大型褐藻MAAs得率随提取温度的升高先增大后略微降低，分别在45℃（海带和裙带菜）或40℃（羊栖菜和马尾藻）时，得率达到最大，这表明适当地升高温度有利于MAAs迅速溶出。

2.1.2 正交试验结果

表4为正交试验结果直观分析，表5为正交试验结果方差分析。

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal tests

表5 正交试验结果方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal tests results

由表5可知，4种大型褐藻MAAs提取过程中，除羊栖菜的因素A不显著外，其余3种大型褐藻的因素A和B均是影响显著的（P＜0.05）因素，因此，提取温度和液料比均维持直观分析结果，不可统一；在裙带菜和马尾藻MAAs提取过程中，因素C是显著（P＜0.05）因素，同样地，也应该维持直观分析结果，不能取相同水平。故此，4种大型褐藻MAAs提取的适宜条件各不相同。对4种大型褐藻MAAs的最佳提取工艺进行验证试验，结果见表6。

表6 4种大型褐藻MAAs的最佳提取工艺Table 6 Optimum extraction process of MAAs from 4 brown macroalga

采用适宜提取工艺（表6），制备到羊栖菜、海带、马尾藻和裙带菜MAAs提取物，它们的MAAs得率依次为31.40%、46.71%、8.29%和21.92%。验证试验得到的得率均高于表4中所有组合的得率。

2.2 MAAs提取物定性检测和鉴定

图5为4种大型褐藻MAAs提取物200nm～400nm波长紫外光谱扫描图。

图5 4种大型褐藻提取物的紫外波长扫描图Fig.5 Ultraviolet wavelength scanning of MAAs extracts from 4 brown macroalga

从图5可以看出，在310 nm～360 nm，马尾藻MAAs提取物有明显吸收峰；其余3种大型褐藻在260 nm～280 nm有吸收峰。研究表明，某些MAAs特征吸收峰为260 nm～280 nm[17]。进一步，采用硅胶薄层层析，对这些MAAs提取物进行定性检测，结果见图6。

图6 4种大型褐藻MAAs提取物的硅胶薄层层析检测Fig.6 Silica gel TLC detection of MAAs extracts from 4 brown macroalga

由图6发现，4种大型褐藻MAAs提取物均在硅胶G板上呈现了黄色斑点。将紫外扫描和薄层层析检测结合，可以对待测样品中的MAAs进行快速筛选。同时，硅胶G板上斑点面积的大小，也能直观反映样品中MAAs含量的高低。

4种大型褐藻MAAs提取物的高效液相色谱图见图7。

图7 4种大型褐藻MAAs提取物的高效液相色谱图Fig.7 HPLC of MAAs extracts from 4 brown macroalga

在图7中，能够清晰地看出4种大型褐藻MAAs提取物在不同停留时间出现吸收峰，表明它们中存在多种MAAs，然而无法确定具体MAAs种类。进一步综合分析质谱和高效液相色谱结果，并参照已有报道[17-18]，鉴定了4种大型褐藻MAAs提取物中MAAs组成，结果见表7。

表7 4种大型褐藻MAAs提取物相对峰面积、最大吸收波长、质谱相应信息和MAAs种类Table 7 Relative peak area，maximum absorption wavelength，corresponding information on mass spectrum，and MAAs species of MAAs from 4 brown macroalga

从表7可以看出，4种大型褐藻MAAs提取物都含 有 shinorine、palythine、porphyra-334 和 palythenic acid 4种MAA，此外，海带和裙带菜中还有未知MAA。

在上述试验基础上，根据MAAs摩尔消光系数，计算得到它们在相应大型褐藻MAAs提取物中的含量，结果见表8。

表8 4种大型褐藻MAAs提取物中MAA含量Table 8 Content of MAA in the MAAs from 4 brown macroalga μg/g

表8结果表明，马尾藻和羊栖菜MAAs提取物中palythenic acid、porphyra-334和shinorine含量明显高于其它3种大型褐藻；羊栖菜MAAs提取物中，palythine含量最高。同时，还发现在同一种大型褐藻中，palythenic acid含量明显高于其它3种MAA含量。在后续研究中，可以对马尾藻和羊栖菜MAAs提取物中的palythenic acid进行纯化制备。

3 结论

本文建立了羊栖菜、海带、马尾藻和裙带菜等4种大型褐藻MAAs提取工艺，优化发现当提取温度、时间和液料比依次为 40、45、45℃和 40℃；2、2、2 h和 3 h；25、20、25 mL/g和 20 mL/g时，MAAs提取物得率最大。经紫外光谱、薄层层析、高效液相色谱和质谱分析，鉴定了4种大型褐藻MAAs提取物的MAAs组成。但尚未建立4种大型褐藻MAAs提取物的分离纯化工艺，后续工作中还需展开MAAs纯化制备研究。MAAs作为一种多功能活性化合物，在食品、医药和化妆品领域展现出巨大的发展前景。本文为大型褐藻MAAs研究提供了良好的技术支撑，并为其它大型海藻MAAs的筛选和鉴定提供了必要的理论参考。