干酪乳杆菌高密度发酵工艺优化

马精阳，姜海龙，袁月明，李锦生，苏佳兴，周丽娜

（吉林农业大学工程技术学院，吉林长春 130118）

乳酸菌是大量应用到我们生产生活中的一类益生菌，安全性已经得到了多方的检验与认可（邹孟琳等，2021；吴军林等，2018）。干酪乳杆菌作为乳酸菌之一，能承受动物机体防御，进入体内后可以保持活性并促进其所在宿主的各项生理指标良性发展，提高免疫力及健康度进而提升生长性能（Deng Ziteng等，2021；陆文伟等，2019；王誉颖等，2019）。围绕着干酪乳杆菌进行的试验越来越多，它的各种功用也慢慢被发现，导致其需求量也随之增加（吕佳璐等，2021；Hernandez-Mendoza等，2009）。因此，在工业生产中如何通过提高其活菌数来获得更高的收益成为研究者倍受关注的问题。杨瑞冬等（2019）研究表明，在生产过程中菌种所需要的营养物质主要来源于发酵液，可以通过确定发酵液成分并辅以环境条件控制来达到最优发酵工艺，从而提升菌种产量（张翠绵等，2019；王丹婷等，2018；于平等，2016）。本研究通过单因素及正交试验对发酵液成分以及发酵过程进行优化，并以活菌数作为测量指标，探究一种高密度发酵工艺，为工厂生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 干酪乳杆菌，保存于吉林农业大学实验室。

1.1.2 试剂 葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸锌、碳酸钠均购于国药集团化学试剂有限公司。红薯淀粉、苹果、橙子、山楂、西瓜均采购于当地市场，将苹果、橙子、山楂、西瓜榨汁后经纱布过滤，并将得到的滤液进行高温高压灭菌用于试验。

1.1.3 基础培养基 使用MRS培养基进行活菌数量测量，去除MRS培养基中的琼脂后作为基础液体培养基使用。

1.2 仪器设备 GR85DR型高压蒸汽灭菌锅：深圳市万千科技有限公司;电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；超净工作台：上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司；LRH-150型恒温生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 干酪乳杆菌菌种的活化 将实验室保存的菌种冻干粉取出，室温静置5 min后在无菌操作台以2%的接种量接种到装有无菌液体MRS培养基的试管中，充分摇匀后在37℃恒温箱中培养48 h得到一代菌，将得到的一代菌再次培养48 h得到二代菌进行试验。

1.3.2 菌种发酵液成分单因素试验 通过单因素试验，分别研究碳源（葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨）、碳氮比（1:1、1:2、1:3、2:1、3:1）、微量元素（硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌）对菌种发酵的影响，选取试验结果排名的前三种，作为后续正交试验的备选成分。

发酵液各物质用量以MRS培养基作为参考，保持浓度不变的的情况下相应替换成试验所用物质。将活化后得到的二代菌液以2%的接种量接种到试验发酵液中，恒温培养24 h后，使用平板涂布法检测活菌数。

1.3.3 菌种发酵液成分正交试验 在单因素试验的基础上进行三水平四因素的正交试验，确定最佳发酵液成分组合。

表1 发酵液成分优化正交试验因素水平

1.3.4 发酵液中添加促生长因子 在最优发酵液成分基础上，分别添加红薯淀粉、苹果汁、橙汁、山楂汁、西瓜汁，测试添加后对菌种发酵的影响。

1.3.5 菌种发酵过程优化 （1）在发酵过程中补充添加最适碳氮源；（2）发酵过程中分别添加碳酸钠和氨水，对发酵液pH进行调节并对比发酵后菌种数量。

1.3.6 发酵后活菌数的测定 取1 mL菌液，稀释10-8后用涂布法使其均匀分布在平板培养基中，将培养基置于37℃恒温箱中，24 h后取出读数，数值扩大108即为原菌液中每毫升含有的活菌数值。

2 结果与分析

2.1 发酵液成分单因素试验

2.1.1 碳源种类对菌种发酵的影响 在碳源组试验中，分别使用了葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖进行菌种发酵测试，通过图1可以看出，发酵效果依次为葡萄糖＞乳糖＞果糖＞蔗糖。其中葡萄糖的发酵效果最佳，发酵后活菌数达到8×108CFU/mL。在分类上，葡萄糖和果糖都属于单糖，在结构式上属于同分异构体，都可以直接参与细胞的生长代谢，但是由于其化学键不同，所产生的能量大小也有着些许差异，导致发酵效果出现差异。而乳糖、蔗糖属于多糖，相比前两种碳源其利用速度更慢，需要先经过细胞产生的分解酶进行分解后再参与细胞的生长代谢。由于在这一段培养时间内葡萄糖提供了更多的能量，导致该组活菌数数值最高。

图1 碳源种类对菌种发酵的影响

2.1.2 氮源种类对菌种发酵的影响 在氮源组试验中，分别使用了牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏进行菌种发酵测试，通过图2可以看出，发酵效果排序依次为牛肉膏＞胰蛋白胨＞蛋白胨＞酵母膏。其中牛肉膏的发酵效果最佳，达到7.4×109CFU/mL。在成分上，牛肉膏当中含有多种物质，例如氨基酸、多肽类、肌酸、肌酸酐核苷酸、甘氨酸、有机酸、矿物质及维生素类，在发酵中提供氮源的同时还可以提供一些菌种所需要的其他微量物质，对菌种发酵起到了很大的促进作用。胰蛋白胨含有丰富的氮源、氨基酸等，但是其成分种类与牛肉膏相比较少，所以活菌数略低于牛肉膏。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类，酵母膏可以提供氨基酸、多肽及有机酸等物质。综合对比结果分析，牛肉膏在发酵中提供的营养物质最为全面，符合菌种快速生长的物质需求，所以其活菌数最高。

图2 氮源种类对菌种发酵的影响

2.1.3 不同碳氮比对菌种发酵的影响 在不同碳氮比试验中，使用相同碳氮源以不同的比例进行发酵。由图3可以看出，发酵效果排序依次为1:2＞1:3＞2:1＞1:1＞3:1。在发酵过程中，添加的碳源最后都要转化为葡萄糖参与菌种的生长代谢，过多的碳源会导致葡萄糖含量增加，引发“克勒勃屈利效应”，即葡萄糖浓度过高反而会抑制菌种的生长，所以在发酵中使氮源含量增加成倍数关系，可有效降低该效应的发生。同时也能提供充足的营养物质使菌种密度增加。

图3 不同碳氮比对菌种发酵的影响

2.1.4 微量元素种类对菌种发酵的影响 在微量元素试验中，由图4可以看出，发酵效果排序为锰＞镁＞铁＞锌。不同的微量元素可以产生不同的作用，锰可以作为超氧化物歧化酶、氨肽酶和L-阿拉伯糖异构酶等的辅因子；镁可以作为固氮酶等的辅因子；铁可以合成菌体组分、维持酶的活性、调节细胞渗透压等；锌可以作为碱性磷酸酶以及多种脱氢酶、肽酶等的辅因子。微量元素与营养物质不同，不能直接用于菌种的生长代谢，试验中锰元素组的活菌数更高，说明在该种试验环境下人为添加锰更符合菌种发酵的需求。

图4 微量元素种类对菌种发酵的影响

2.2 发酵液成分正交试验优化 由表2可以看出，在当前试验环境条件下，对发酵效果产生影响的因素排序为碳源＞氮源＞微量元素＞碳氮比，作为菌种生命活动的主要能量及营养物质来源，在发酵液中合理使用碳源、氮源将对菌种最终的发酵密度产生主要影响。通过正交试验确定最优条件为A2B1D2C1，发酵液基础成分为乳糖5 g/L、牛肉膏10 g/L、硫酸镁0.2 g/L，在此条件下发酵后菌种浓度为6.2×109CFU/mL。

表2 发酵液成分优化正交试验结果

2.3 促生长因子对发酵的影响 在菌种生长过程中，有一些物质难以依靠本体提供，需要通过外部获取，这一类物质包括维生素、生物素、烟酸等等。由图5可以看出，对发酵效果影响排序为苹果汁＞橙汁＞山楂汁＞红薯淀粉＞西瓜汁，作为菌种生长因子来源，不同材料所含有的物质也不尽相同，例如苹果中含有糖类、维生素类及微量元素类等等，可以在发酵过程中对营养物质进行补充。使用排序前三位的材料，在发酵液基础成分上添加10 mL/L的混合生长因子溶液（苹果汁：橙汁：山楂汁=3:2:1）。

图5 不同生长因子对菌种发酵的影响

2.4 干酪乳杆菌发酵过程优化

2.4.1 发酵期间添加乳糖与牛肉膏 菌种发酵过程中，随着时间推移，发酵液中营养物质含量随之减少，此时补充适量的碳氮源可以维持菌种继续生长，以提高发酵结束时的菌种密度。

通过图6可以看出，在分别补充不同浓度的乳糖之后，发酵效果排序为0.3%＞0.4%＞0.5%＞0.2%＞0.1%。添加量超过0.3%后，菌种密度反而出现下降趋势，可能是碳源过多导致菌种不能完全消耗其分解的产物，出现葡萄糖堆积，抑制了菌种发酵效率。因此选择在培养24 h后向发酵液中添加0.3%的乳糖来达到补充碳源的目的。

图6 发酵期间乳糖补充量对发酵的影响

通过图7可以看出，在补充不同浓度的牛肉膏之后，发酵效果最好的是0.8%这一组，添加量大于0.8%时各组数据出现不稳定状态，可能是随着氮源含量的增加导致碳氮比相应出现变化，使得原本发酵液的发酵环境被改变，菌种的生长性能随之波动并呈现出下降趋势。因此选择在培养24 h后向发酵液中添加0.8%的牛肉膏来补充氮源。

图7 发酵期间牛肉膏补充量对发酵的影响

2.4.2 发酵期间添加碳酸钠与氨水 干酪乳杆菌在发酵过程中，菌体会产生L型旋光性乳酸，导致发酵环境的pH逐渐降低，最终严重影响活菌密度，因此需要在发酵时对发酵液pH进行调节。通过图8可以看出，添加不同浓度的碳酸钠之后，菌种浓度出现差别，其中添加浓度为2.5%时密度最高，达到2.9×109CFU/mL。

图8 发酵期间碳酸钠添加量对发酵的影响

通过图9可以看出，添加氨水浓度为4%时菌种密度最高，达到3.6×109CFU/mL。综合对比两组试验，添加氨水后发酵环境更适宜菌种发酵，因此选择在培养24 h后向发酵液中添加4%的氨水来调节酸碱度，保证菌种生长环境。

图9 发酵期间氨水添加量对发酵的影响

3 结论

本试验结果表明，干酪乳杆菌最优发酵工艺为：对所用材料全部进行灭菌操作后，在无氧密闭的环境内以温度为37℃、pH为6.5、接种量为2%的初始条件进行发酵，在此条件下使用乳糖5 g/L、牛肉膏10 g/L、硫酸镁0.2 g/L、混合生长因子溶液（苹果汁：橙汁：山楂汁=3:2:1）10 mL/L的发酵液进行恒温无氧发酵；24 h后向发酵液中添加浓度0.3%的乳糖、0.8%的牛肉膏与4%的氨水，继续发酵24 h后收获菌种。在此发酵工艺条件下，收获的菌种密度可达到2.8×1010CFU/mL。