影响苯胺法检测游离棉酚的因素分析研究

柴 燃，季绍东，史自强，吴 迪，宋伟光，高 伟

（1.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸 056250；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸市天然产物与功能性食品开发重点实验室，河北邯郸 056038；3.河北省植物资源综合利用重点实验室（筹），河北邯郸 056107）

棉籽中含有大量油脂和丰富蛋白质，可用作食品和饲料中蛋白质、油脂的来源。我国棉籽年产量约1000万t，居世界首位，若能充分利用可显著降低我国粮食供应风险。但棉籽的色腺体中包含棉酚，占棉籽总重量的0.4%～2%（Cai等，2004）。尽管棉酚具有抗生育（Sharaky等，2010）、抗肿瘤（Zeng等，2019）等生物活性，但游离棉酚含量过高会影响哺乳动物（Zhu等，2020）和禽类（Farthing等，2019）的正常生理过程。棉酚的存在限制了棉籽相关产品在食品和饲料中的应用（Lv等，2010）。棉酚在棉籽产品中有两种存在形式，分别是游离状态的棉酚（FG）和结合状态的棉酚（BG）。结合棉酚是通过棉酚上的醛基与蛋白质、氨基酸的游离氨基之间发生反应，形成共价化合物（Lu等，2017）。游离棉酚的活性醛基和活性羟基处于游离状态（Khalaf等，2008），易与动物体内的蛋白质、氨基酸等发生反应，干扰正常生理过程，产生毒性。结合棉酚由于活性基团与其他物质结合（Pons等，1977），对动物的健康影响不大（Gadelha等，2014），因此在国家和行业标准中，棉籽蛋白、棉籽油和棉籽粕的关键性控制指标为游离棉酚的含量。

不同棉籽产品采用的检测方法不同。棉籽油和植物性食品采用高效液相法检测游离棉酚；当棉籽产品用作饲料时，采用苯胺法检测游离棉酚；而脱酚棉籽蛋白这两种方法均可。脱酚棉籽蛋白作为一种用于饲料的新型蛋白原料，与传统棉籽加工而成的棉籽粕有着巨大区别。《脱酚棉籽蛋白》（GH/T1042-2007）行业标准明确了脱酚棉籽蛋白的质量指标：粗蛋白质含量大于50%，以分光光度计法测定的游离棉酚不得超过400 mg/kg、高效液相色谱（HPLC）法测定的游离棉酚不得超过60 mg/kg。高效液相色谱法检测标准明显要高于分光光度计法，但对分光光度计法和高效色谱法检测结果差异的具体原因鲜见研究报道。分光光度计法分为苯胺法和间苯三酚法（Thatching等，2008）。我国饲料行业的最新标准《饲料中游离棉酚的检测》（GB 13086-2020）和欧盟采用的是苯胺法，因此本研究中采用苯胺法检测样品中的棉酚含量，通过比较苯胺法和高效液相色谱法的结果差异，研究影响苯胺法检测的因素，这对于棉酚的检测研究和棉籽产品的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）、恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、紫外分光光度计（日本岛津公司）、超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）、纯水仪、振荡器（常州国华电器有限公司）。

1.1.2 试剂和材料 正己烷、苯胺、异丙醇、冰乙酸、3-氨基-1-丙醇、丙酮、磷酸购自天津光复试剂，均为分析纯；色谱纯丙酮、乙醇、甲醇和棉酚标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米淀粉购自上海麦克林生化公司；棉籽油见自河北晨光生物科技集团。为保证苯胺的纯度，在使用之前加入锌粒进行蒸馏提纯处理。

1.2 实验方法

1.2.1 苯胺法检测棉酚 按照GB/T 13086-2020《饲料中游离棉酚的测定方法》规定的检测步骤进行。溶剂A的配制：将异丙醇/正己烷（500 mL，6：4，V/V）混合溶剂、冰醋酸（8 mL）、纯水（50 mL）和3-氨基-1-丙醇（2 mL）置于1 L的容量瓶中，再用异丙醇/正己烷混合溶剂补足。

1.2.2 高效液相色谱法检测棉酚 参考GB 5009.148-2014《植物性食品中游离棉酚的测定方法》中规定的检测步骤，萃取液采用乙醇或丙酮。液相色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），检测波长：235 nm，柱温：40℃，进样量：10μL，流速：1.0 mL/min，流动相为0.5%磷酸水溶液：甲醇=15：85。

1.2.3 棉酚氧化物对棉酚检测的影响 称取0.1 g棉酚至烧杯中，加入9.9 g玉米淀粉，搅拌均匀，常压下120℃烘干4 h，分别采用苯胺法和高效液相色谱法检测游离棉酚。

1.2.4 油脂氧化对棉酚检测的影响 精确称取9 g玉米淀粉转移至烧杯中，加入1 g（质量分数10%）棉籽油，搅拌均匀。鼓风干燥箱中120℃烘干4 h后采用苯胺法检测样品加热前后的游离棉酚变化。

1.2.5 黄酮类对棉酚检测的影响 称取9.5 g玉米淀粉和0.5 g（质量分数5%）槲皮素转到烧杯中，搅拌均匀，采用苯胺法检测游离棉酚。

1.2.6 糖类对棉酚检测的影响 称取9.5 g玉米淀粉3份，分别加入0.5 g（质量分数5%）葡萄糖、0.5 g棉子糖和0.5 g蔗糖，转移到烧杯中，搅拌均匀，采用苯胺法检测游离棉酚。

1.3 数据处理 所有试验均设置平行实验（n=3），利用Microsoft Excel 2013进行收集整理，数据分析通过SPSS软件进行，以“平均值±标准差”表示结果，采用one-way ANOVA方法比较组间的差异。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法和苯胺法检测棉酚 高效液相法检测棉酚含量按照国家标准规定，以乙醇作为溶剂萃取脱酚棉籽蛋白的游离棉酚后，通过液相色谱检测含量，脱酚棉籽蛋白的检测结果相对苯酚法的检测结果都显著偏低，平均偏低85%（P<0.05）。

相同条件下，将丙酮作为溶剂萃取游离棉酚，脱酚棉籽蛋白的液相色谱检测结果相对苯胺法的检测结果也都是显著偏低，平均偏低89%（P<0.05），趋势与乙醇萃取实验的一致（表1）。这些结果表明苯胺法检测游离棉酚的数值偏高，因此进一步对影响苯胺法检测游离棉酚的因素进行分析研究。

表1 不同溶剂萃取脱酚棉籽蛋白的游离棉酚检测结果 mg/kg

2.2 棉酚氧化物对棉酚检测的影响 将棉酚以及在120℃常压环境下氧化4 h后的棉酚，分别用苯胺法和高效液相色谱检测游离棉酚含量。结果如表2所示，棉酚加热前苯胺法和高效液相法检测的游离棉酚含量相差不大；将棉酚氧化后，高效液相法检测游离棉酚明显低于棉酚氧化前的含量，苯胺法检测结果比高效液相法的结果高出43.6%。这是由于棉酚在空气中加热，会在氧气作用下氧化形成棉醌（Howell等，2000），颜色由浅黄色变深黄色。但棉酚上的醛基得到保留，保证棉醌依旧能够与苯胺反应，影响游离棉酚检测结果，导致与棉酚氧化前的结果基本相同。

表2 苯胺法和液相法检测棉酚氧化物中的游离棉酚 mg/kg

2.3 油脂氧化对棉酚检测的影响 将棉籽油在高温环境下加速氧化，检测加热前后棉酚含量的变化。如表3所示，苯胺法检测结果显示烘干后游离棉酚的含量是烘干前的6.93倍（P<0.05），表明油脂氧化会导致检测结果偏高。王美霞（2016）对棉籽油进行研究，发现其含有多种脂肪酸，主要成分为亚油酸、棕榈酸、油酸，还有少量亚麻酸、花生酸。不饱和脂肪酸在棉籽油中的含量高达70%以上，其在氧气存在下会氧化分解为一次产物，一次产物不稳定会进一步氧化分解生成二次产物（羰基化合物），如酮、醛、酸等（王宪青等，2003）。醛类物质能够与苯胺发生反应，使苯胺法检测棉酚的结果偏高。

表3 油脂氧化对苯胺法检测游离棉酚的影响mg/kg

2.4 黄酮类对棉酚检测的影响 棉籽中存在多种黄酮类物质，包括槲皮素（Lukefahr，2016）、山奈酚（张庆建等，2001）、棉黄素（Khan，2013）等，其中槲皮素含量最丰富（额尔敦巴雅尔等，2021）。为确定黄酮类物质对苯胺法检测的影响，在玉米淀粉中加入5%槲皮素后进行检测。如表4所示，添加槲皮素之后，苯胺法测得的游离棉酚含量提高16.75倍（P<0.05），这表明黄酮类物质也能干扰苯胺法检测游离棉酚，可能是由于黄酮上的酮基在加热情况下与苯胺发生反应，使440 nm吸光度增加，导致检测结果偏高。

表4 槲皮素对苯胺法检测游离棉酚的影响mg/kg

2.5 糖类对棉酚检测的影响 棉籽中含糖类较多，主要包括棉子糖、蔗糖、葡萄糖（Xu等，2022）。如表5所示，三种糖类中，棉子糖和蔗糖对游离棉酚检测数值没有影响，葡萄糖使游离棉酚检测数值比空白对照升高12.9倍（P<0.05），明显影响苯胺法的检测结果。作为测试样品三种糖中，棉子糖、蔗糖属于非还原糖，只有葡萄糖是还原糖，还原糖在加热过程中部分暴露醛基，与苯胺发生反应，导致游离棉酚结果偏高。

表5 糖类对苯胺法检测游离棉酚的影响mg/kg

3 结论

本实验结果表明，棉籽中存在的多种天然化合物都能干扰苯胺法检测游离棉酚，包括棉酚衍生物、油脂氧化产物、黄酮类物质和还原糖。另外，苯胺容易变质，使用之前需要提纯（朱利民等，2017），费时费力，且检测误差高达10%，逐渐无法满足生产经营中对棉酚检测及时性和准确性的要求。因此，测定棉籽相关产品中的游离棉酚，选用高效液相色谱法进行检测更为快速和精确。