陕西杨凌某鸡场鸡艾美耳球虫的分离鉴定

田格如，崔 博，宋军科

(1.杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100；2.北京市东城区动物卫生监督所，北京 100027；3.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属(Eimeria)多种球虫寄生于鸡的肠黏膜上皮细胞引起的寄生原虫病，对养鸡业危害很大。鸡球虫的主要致病作用是破坏肠黏膜上皮细胞，导致出血性肠炎、肠黏膜上皮细胞脱落和营养物质吸收不良，对宿主的肠道造成很大的伤害，可增加其发病率和病死率[1]。鸡球虫病对养禽业造成的生产损失已成为一种全球性挑战，每年可达约30 亿美元的经济损失，使得控制疾病的预防措施成为根本[2-3]。目前，我国发现9种鸡艾美耳球虫种类，普遍存在的有7种[4-5]，其中致病力最强的是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)，可引起鸡的盲肠肿胀和肠腔中充满血液；其次是毒害艾美耳球虫(E.necatrix)，导致肠壁肿胀或坏死；其余依次是堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)以及早熟艾美耳球虫(E.praecox)。

目前，基于鸡球虫卵囊形态、寄生部位的特异性以及病理变化特征的常规检查易出现漏检情况[6]。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)具有很高的特异性和敏感性，基于PCR的艾美球虫属的鉴定更具有灵敏度高、准确度高等优点，因此，被广泛用于球虫物种的鉴定上[7]。内转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)位于真核细胞中的核糖体RNA上，尽管种内存在一定的保守性，但物种间具有很大的差异性，可用作DNA标记，以帮助识别各种疾病，包括艾美耳球虫的感染[8-9]。据报道用ITS引物基于PCR技术已成功鉴定了7种鸡艾美耳球虫，在物种鉴定方面取得了重大进展[10]。

准确有效地鉴定病原体对于球虫病的诊断和控制、生物学和流行病学研究、新型免疫原的生产以及抗球虫药物的筛选都具有重大意义[11]。因此，本文对杨凌地区某鸡场疑似鸡球虫进行分离纯化、形态学和PCR鉴定，并对其致病性和生物特性进行初步研究，可为鸡艾美耳球虫优势种的疫苗研制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 2日龄健康海兰雏鸡，购自杨凌某种鸡场，经检测未感染球虫。

1.1.2 试验用样本 陕西杨凌某鸡场疑似患球虫病的病鸡粪便。

1.1.3 主要试剂 粪便DNA试剂盒为Qiagen公司产品；rTaq聚合酶(5 U/mL)、dNTP(2.5 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)、10×rTaqbuffer、溴化乙锭(ethidium bromide，EB)、DNA标准DL 2 000，均为TaKaRa公司产品；重铬酸钾( K2CrO4) 、生理盐水、蒸馏水(dH2O)、氯化钠(NaCl)，均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器 光学显微镜(CH20)，Olympus公司产品；常温离心机(5702)、PCR扩增仪(Mastercycler X50),均为Eppendorf公司产品；凝胶成像系统(ChemiDoc XRS)、电泳仪(CFX384 Touch),均为Bio-Rad公司产品；超净工作台(LHG-3-G-F8)，青岛翌宏仪器有限公司产品；恒温培养箱(DF811C)，Yamato公司产品；电子天平(XS105DU)，Mettler Toledo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鸡球虫采集与分离 采集具有鸡球虫病典型临床症状的鸡只粪便，放于清洁干燥的烧杯中，添加适量蒸馏水用玻璃棒搅拌均匀后，用200目网筛进行过滤。滤液于3 000 r/min离心5 min，倒掉上清液；加一定体积的饱和食盐水溶液混匀，2 000 r/min离心5 min；吸取上清液放于清洁干燥的烧杯中，加蒸馏水(6倍体积的上清液)进行稀释，2 000 r/min离心5 min；倒掉上清液，加适量蒸馏水混匀，2 000 r/min离心5 min；反复用蒸馏水清洗3遍后进行重悬，在显微镜下镜检。

1.2.2 球虫卵囊的孢子化培养 在上述分离到的球虫卵囊混悬液中加入3倍体积的25 mg/mL K2CrO4溶液，用移液枪反复吹打混匀后转移至培养皿，于28 ℃培养箱中孵育。在孵育过程中每隔2 h用移液枪轻轻吹打，48 h后镜检，如孢子化率达90%以上即可转移至离心管中停止培养。

1.2.3 鸡球虫的扩繁

1.2.3.1 接种孢子化卵囊 将保存在K2CrO4溶液中的孢子化野毒株用蒸馏水进行稀释，3 000 r/min离心5 min，倒掉上清。加一定体积的蒸馏水混匀后用血细胞计数板计数，计算虫卵密度，稀释至约10 000个/mL。选取15日龄健康无球虫海蓝雏鸡10只，停饲2 h后每只鸡经口灌服0.1 mL约1 000个卵囊。

1.2.3.2 排卵囊规律检测 从感染后第1天开始分别在上午8:00和晚上20:00收集鸡只粪便，计算每克粪便的卵囊数(OPG)。当OPG降低时剖杀鸡只并取其消化道内容物，通过临床症状、病理变化、卵囊大小、卵囊形态特征对分离到的卵囊进行初步鉴定。

1.2.4 鸡球虫PCR鉴定 收集的卵囊用粪便DNA试剂盒提取DNA。本研究根据ITS基因设计出4种艾美耳球虫的特异性引物[12]，引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系：10×rTaqbuffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 U/mL rTaq聚合酶0.125 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 16.375 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 2 min，16 ℃结束反应。取4 μL PCR扩增产物在含有EB的10 g/L琼脂糖凝胶电泳中检测。

表1 鸡艾美耳球虫的特异性引物

1.2.5 测序及序列分析 PCR阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司双向测序，应用Clustal X 1.83软件对所测的序列进行比对，然后将拼接的序列在Blast上进行同源性检索，分析序列的同源性。

2 结果

2.1 鸡球虫分离及其孢子化

采用饱和盐水溶液漂浮法对鸡球虫卵囊进行分离，镜检发现分离物中存在大小约为22 μm×19 μm，囊壁光滑未孢子化的卵圆形卵囊(图1)。将获得的球虫卵囊放于25 mg/mL K2CrO4溶液中于28 ℃孵育48 h，进行孢子化，镜检发现孢子化的卵囊具有分化明显的4个孢子囊，每个孢子囊含2个子孢子，有斯氏体，无卵囊残体(图2)。计数50个卵囊，其中孢子化成熟的卵囊有46个，孢子化率为92%。

2.2 鸡艾美耳球虫的排卵囊规律

感染球虫卵囊后第4天有个别鸡状态不佳，第5天部分雏鸡表现食欲不佳、精神不振、翅膀下垂等临床症状，第6天出现腹泻以及血便现象。检测鸡只的粪便，在第5天首次发现球虫卵囊，最短潜隐期在118 h～120 h之间；第7天出现排卵囊高峰(图3)。第8天处死鸡只，剖检可见盲肠和小肠有充血和出血现象。

图1 未孢子化球虫卵囊(400×)

图2 孢子化球虫卵囊(400×)

2.3 鸡艾美耳球虫ITS基因PCR扩增及鉴定

提取收集到的球虫卵囊的DNA，再进行PCR扩增，经凝胶电泳检测，结果显示只有毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫出现了约450 bp和300 bp的目的条带(图4)。

2.4 PCR产物序列分析

所测得的序列去除两端不准确序列后，毒害艾美耳球虫序列为452 bp,柔嫩艾美耳球虫序列为280 bp。将拼接后的两条序列分别在Blast上检索，结果显示毒害艾美耳球虫与E.necatrix(GenBank登录号AF026385)同源性为98%，柔嫩艾美耳球虫与E.tenella(GenBank登录号JX853831)同源性为99%。

图3 鸡接种1 000个球虫卵囊后的排卵囊规律

M.DNA标准DL 2 000；1～4.分别为堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫的PCR扩增产物

3 讨论

鸡球虫是一种寄生于鸡肠道内的寄生性原虫，主要侵害宿主肠道细胞，由其引起的鸡球虫病对鸡的生长发育及生产性能造成严重的危害。据报道，全球工业化养鸡场中，球虫病的感染率是10%～90%，给家禽生产者带来重大的经济损失[13-14]。鸡艾美耳属球虫因种和寄生部位不同而造成的危害程度各不相同。E.necatrix和E.tenella是7种鸡艾美耳属球虫中致病性最强的2个种，可导致病鸡的血样腹泻，并且是致命性的危害[15]。

鸡球虫传统上主要依据卵囊的形态和大小、发病日龄、宿主特异性以及病理变化特征进行种类鉴定[16-17]。但传统的鉴定方法在鉴别不同球虫虫株时有很多相似之处，用肉眼难以辨别。利用PCR方法对鸡球虫种类的鉴定具有快速、简便且准确性高的特点，被广泛应用于规模化养禽业的检测。本试验通过饱和盐水溶液漂浮法从鸡粪便和消化道内容物中成功分离出鸡球虫卵囊，并通过形态学特征以及动物感染试验初步鉴定为鸡艾美耳属球虫，鸡球虫卵囊大小约为22 μm×19 μm，囊壁光滑未孢子化的球虫卵囊。鸡球虫卵囊接种15日龄雏鸡6 d后出现腹泻和明显血便，将鸡只剖杀后从消化道内容物中又分离到了球虫卵囊。经显微镜观察从形态大小上排除了巨型艾美耳球虫和和缓艾美耳球虫，最短潜隐期超过了早熟艾美耳球虫的潜隐期，又排除了早熟艾美耳球虫。ITS基因序列具有种内高保守性和种间特异性，常用于球虫虫株的分类鉴定。陈培培等[18]根据 ITS序列利用PCR技术扩增诊断为柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的混合感染。谢永平等[19]根据ITS-1基因序列进行PCR扩增诊断为柔嫩艾美耳球虫。由于本试验在形态特征上已排除以上3种球虫的感染，因此根据ITS序列分别设计其余4种特异性引物进行PCR鉴定，其中E.necatrix和E.tenella出现了目的条带，表明该鸡场为这2种球虫的混合感染。

鸡球虫给全球养禽业带来了重大的经济损失和福利风险，尤其是富含高蛋白和快速繁殖的鸡[20]。有研究表明感染鸡球虫的鸡群其肠道功能难以完全康复，导致营养物质吸收不良、体重增加缓慢和生产性能下降，从而导致鸡的的死亡率和继发疾病的易感性增加[21]。因此，了解现有的艾美耳球虫物种概况，有利于在养禽业实施有效的控制策略。本次分离鉴定结果可为杨凌地区防控鸡球虫病奠定基础，但对于整个杨凌地区并未做全面的采样及检测，所以对目前鸡艾美耳球虫的流行病学还有待进一步研究。