基于新生儿脐血TEL-AML1 融合基因检测的儿童急性白血病筛查体系的建立及意义

赵亚玲 ，武 坤 ，黄 蓉 ，何根娅 ，丁臻博 ，张彩营

（1）昆明医科大学第一附属医院儿科;2）医学检验科;3）产科，云南 昆明 650032）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童白血病中最常见的类型。虽然儿童白血病治疗有85%～90%的长期生存率，但大多数治愈的儿童面临长期化疗药物副作用，复发性ALL 的预后仍然不令人满意，仅40%的长期生存率[1-2]，因此，儿童急性白血病早期筛查体系的建立对预防和早期诊断将具有重要意义。儿童白血病的一个重要特征为基因组的不稳定性，表现为染色体的重排、缺失、多倍体等。TELAML1 融合基因伴随的t（12;21）（p13;q22）染色体异常被认为是儿童ALL 中最常见的细胞遗传学异常，在不同国家或地区的儿童ALL 发病者中阳性率可达到20%～30%[3]。大量回顾性分析B-ALL患儿早期保留的新生儿血液斑点卡发现TELAML1 融合基因早在胎儿造血期就已形成[4]，这提示TEL-AML1 融合基因的异常发生于白血病患儿出生前，因此，对新生儿脐血TEL-AML1 融合基因的检测有助于急性白血病的早期筛查。本研究旨在通过RT-PCR 方法检测新生儿脐血TELAML1 融合基因，构建儿童急性白血病筛查体系，并探讨其临床意义，为临床上开展早期筛查儿童急性淋巴细胞白血病提供依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料

1.1.1 研究对象本研究选择2018 年1 月至2021 年1 月在昆明医科大学第一附属医院产科出生的健康新生儿2 480 例作为研究对象。上述研究对象必须同时满足下列条件[5]：（1）单胎；（2）胎龄≥37 周；（3）家长同意加入研究，并能坚持随访；（4）母亲能用中文回答问卷调查；（5）孕期至分娩期间一直居住在昆明；（6）母亲妊娠期间定期在昆明医科大学第一附属医院产检。

1.1.2 高危新生儿筛选本研究首先通过问卷调查，筛选出具有发生儿童急性白血病高危因素的人群。高危因素：（1）母亲高龄：年龄大于40 岁；（2）母亲或父亲吸烟；（3）出生体重大于4 000 g；（4）家族中有白血病肿瘤病史；（5）家庭新装修。

本研究获得昆明医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准及新生儿家长的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 问卷调查通过问卷调查方式筛选出高危新生儿，根据研究显示母亲高龄、母亲或父亲吸烟、出生体重大于4 000 g、家族中有白血病肿瘤病史、家庭新装修的新生儿，其白血病发生风险高于同龄儿童[6-8]，问卷设计新生儿及母亲资料、父母主要环境暴露因素信息及肿瘤家族病史等3个方面，并对其进行信及度效度分析。本研究采用内容效度来评价问卷的效度，采用专家评分和因子分析评估；信度采用Cronbach’s α 系数评估。白血病高危新生儿调查问卷题项水平的内容效度指数为0.85～1.00，Cronbach’s α 系数为0.83，提示白血病高危新生儿调查问卷具有良好的信度及效度。本研究共有1870 例新生儿接受调查，共回收1 500 份问卷，有效问卷1 200 份。

1.2.2 标本收集经家属和孕妇本人的同意，由课题组指定的专人来负责收集出生时脐血5 mL，所有标本均用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝处理。所有标本均来源于昆明医科大学第一附属医院产科2018 年1 月至2021 年1 月出生的新生儿，共收集231 份标本。

1.2.3 仪器与试剂人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司）；生理盐水（昆明南疆制药有限公司）；TRIzol 试剂（TaKaRa 公司）；白血病融合基因检测试剂盒（TEL-AML1 二步法）（上海源奇生物医药科技有限公司，批号：20200418）；异丙醇、氯仿（重庆川东化工有限公司）；无水乙醇（安徽安特食品固粉有限公司）；RAase-free Water（TaKaRa 公司）；无酶无菌水（Solarbio 公司）；75%乙醇用无酶无菌水水配置。

SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台（苏州净化）；L535R 低温离心机（湘仪）；SORVALL LEGEND MICRO 17R 高速冷冻离心机（Thermo 公司）；PCR Thermai Cycler Dice TP600（TaKaRa 公司）；7500 Real Time PCR system（Applied Biosystems 公司）。

1.2.4 RNA 提取方法（1）单个核细胞收集在出生后12～24 h 内，从健康足月新生儿的脐带血（umbilical cord blood，UCB）样本中分离出单核细胞（mononuclear cells，MNCs）以减少细胞和/或mRNA 的降解。将乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血颠倒混匀后用吸管沿管壁缓慢加入装有6 mL 人外周血淋巴细胞分离液的试管中，3 000 r/min 离心15 min，转移中间白膜层到装有6 mL 生理盐水的新试管中，3 000 r/min 离心15 min，弃上清，留取沉淀；（2）总RNA（mRNA）提取 MNCs 计数 ≥25×106，提取mRNA，分成2 管，在-80 ℃下保存备用。取400 µL 富集的单个核细胞立即加入600 µL Trizol 试剂，充分混匀后，室温放置10 min，加入400 µL 氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，转移上层水相到新管中，加入600 µL 异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，弃去上清，用 1 mL 75% 乙醇洗涤RNA 沉淀，12 000 r/min 离心10 min，弃上清，室温放置干燥RNA 沉淀，加入100 µL RAase-free 水，溶 解RNA；（3）PCR 扩增 逆转录PCR 仪采用TaKaRa公司的PCR Thermai Cycler Dice TP600，反应体系为：6 µL MIX1+4 µL MIX2+10 µL RNA；PCR逆转录条件为：37 ℃，60 min；70 ℃，10 min；4 ℃保存。实时荧光定量PCR 仪使用ABI 公司的ABI7500，定量反应体系为：7 µLTEL-AML1 MIX/内参基因MIX+13 µLPCR MIX+5 µLcDNA模板量；PCR 循环参数为：42 ℃，5 min，94 ℃，3 min；（94 ℃，15 sec，60 ℃，60 sec）40 个循环。在循环第二步60 ℃时收集荧光信号，检测通道为FAM-TAMRA，参比荧光设定为none；（4）荧光PCR 标准曲线绘制及各样本融合基因拷贝数测定 在PCR 反应结束后，设定基线水平和阈值，ABI7500 软件会自动绘制标准曲线及扩增曲线（图1A、图1B），并根据标准曲线计算各样本融合基因和内参基因的绝对拷贝数，目的融合基因与内参基因的拷贝数比值需自行计算；（5）存储的mRNA 标本TEL-AML1 融合基因检测 为排除实验假阴性，通过对存储的231 例mRNA 标本再次进行TEL-AML1 融合基因检测。

图1 TEL-AML1 标准曲线及扩增曲线Fig.1 TEL-AML1 standard and amplification curve

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0 统计软件进行数据统计。计数资料以例数（n）和率（%）表示；计量资料以均数±标准差（）表示。

2 结果

2.1 新生儿一般资料

平均胎龄为（39±0.6）周，其中男118 例（51.1%），女113 例（48.9%）。

2.2 平均耗费时间

从出生到样品处理（即MNC 收获、mRNA 分离）的平均时间为（12.3±0.6 h）（0.5～23.5 h）。

2.3 脐血单核细胞计数

平均为（26.8±0.72）×106（18.2×106～32.8×106），ABL（CtABL）的平均周期阈值为（24.01±0.36）（95%区间：21.49～26.53）。

2.4 TEL-AML 融合基因检出率

在第1 次筛查中，231 份脐血样品EL-AML融合基因检测均为阴性。通过重新筛选存储的mRNA 都无法确认阳性信号。

2.5 平均费用、患者满意度及接受率

平均费用为每份标本200 元，患者满意度及接受率均为100%。

3 讨论

儿童急性白血病的发展是由2 种遗传异常的积累所驱动的多步骤的过程。原发性异常或“第一次命中”代表一个初始事件，通常是染色体易位产生白血病前基因融合，具有损害造血干细胞/祖细胞分化的新活性，这些基因融合主要发生在子宫内的胎儿造血过程中，产生一个持续但临床隐蔽的白血病前克隆[9-10]，因此，脐带血融合基因的筛查对于制定儿童白血病的预防和治疗策略具有重要意义[11]，基于以上理论，本研究建立了以检测新生儿脐血TEL-AML1 融合基因为基础的儿童急性淋巴细胞白血病早期筛查体系，并成功将其应用到临床中。

本筛查体系包括2 部分：高危人群筛选及脐血TEL-AML1 融合基因检测。（1）在母亲分娩前通过问卷调查方式筛选出高危人群。研究显示母亲高龄、母亲或父亲吸烟、出生体重大于4 000 g、家族中有白血病肿瘤病史、家庭新装修及试管婴儿的新生儿，其白血病发生风险高于同龄儿童[6-8]，因此，笔者在问卷调查中将这些因素列为高危因素，具备一项及以上高危因素者即可入组。这表明本研究对象具有很强的针对性，避免了盲目性；（2）收集脐血及融合基因检测。在此阶段，收集新生儿脐血时，必须在出生时断脐后立即收集脐血，随后采用RT-PCR 方法，对231 份新鲜脐血标本迅速进行TEL-AML1 融合基因的检测。与冻存标本相比，新鲜标本的检测更加准确，耗时更少，费用更低。此外，为了避免假阳性，我们在实验中采取了严格的预防措施，以防止标本污染，将所有脐带血标本都与可能包含任何被测试转录本的材料分开处理，所有步骤均纳入阴性对照及阳性对照。其次为了避免假阴性，评估和比较本研究PCR 检测技术的敏感性水平，笔者对RT-PCR 进行了敏感性测试，灵敏度1×10-5，每个样本重复3 次。这些措施保证了本研究实验结果的准确性。

本研究的结果显示在高危新生儿脐血标本中并未检测到TEL-AML1 融合基因，分析其原因可能是以下几方面的原因：（1）样本量过小，本研究在有限的时间内连续收集到231 份样本，在大规模筛查实验中显得不足，因此，增加研究的样本量可能会提高其检出率；（2）PCR 检测灵敏度也可能影响检测率，本研究PCR 的敏感性约为10-5。Pavol 等[12]的研究显示大多数PFG 阳性脐血PFG的数量非常接近RT-qPCR 敏感性阈值，大约每10 万个细胞达到1～3 个拷贝，该研究结果强调了筛选方法的灵敏度局限性，如果所获得的数据仅略高于灵敏度水平，则只能对融合基因发生率进行近似估计，这说明PCR 检测的灵敏度将会对基因的检出率产生较大的影响，下一步本筛查系统将探索应用新的检测方法，确保灵敏度至少1×10-6。

复习文献，笔者发现对新生儿脐血中融合基因的检测在白血病的筛查中具有很高的应用价值及科学性。2002 年，Mori 等[13]的研究报道脐血中TEL-AML1 的发生率为1.05%，这项研究是第1 个使用 RT-qPCR 在健康个体中检测PFG 的研究。该方法的灵敏度为10-3～10-4，尽管无法排除首次嵌套式 RT-PCR 中发生交叉污染的风险，但由于该研究具有567 个先证者的验证，因此报告的结果似乎非常可靠。后来多数研究的结果均显示TEL-AML1 融合导致染色体易位发生在相对较高的比例（1%）[14-15]，考虑到儿童中TELAML1+ALL 的累积发病率（1：10 000，即0.01%），它预测在100 个携带可检测到的TEL-AML1 转录本的新生儿中，只有1 个注定会发展为ALL[16]，这在一定程度降低了脐血筛查融合基因对白血病前克隆存在的意义。Lausten-Thomsen 等[17]的研究小组对这一观点提出了挑战，其研究发现可检测到TEL-AML1 转录本的新生儿比例实际上可能要低得多（0.01%），这意味着出生时可检测到TELAML1 融合的婴儿最终将可能100%发展为TELAML1 阳性 ALL，显而易见，脐血融合基因检出率越低，建立以脐血融合基因检为基础的白血病筛查对于防治在ALL 的发生更具有重要意义。

本研究中结果显示可检测到TEL-AML1 融合基因的发生率趋势与Lausten-Thomse 等[17]的研究一致，但明显低于其他研究，排除使用因素所致假阴性外，越低的检出率意味着融合基因的发生与急性淋巴细胞白血病发生的相关性越强。事实上，新近的一项研究也得出了与本研究类似的结果[3]，由此可见，并不能因为阴性结果而否定新生儿脐血中融合基因检测的作用，因此，本研究基于新生儿脐血融合基因检测而建立的儿童急性白血病筛查体系具有一定的科学性。

总之，本研究成功构建了一种以新生儿脐血TEL-AML1 融合基因检测为手段的儿童急性淋巴细胞白血病早期筛查体系，在理论上具有科学性，在临床上具有可行性，耗时短，费用低，接受率高，为临床上开展早期筛查儿童急性淋巴细胞白血病提供依据。尽管其阳性细胞的频率和/或水平低于先前报道的水平，但进一步增加样本量有可能提高TEL-AML1 融合基因的检出率。此外，增加其它融合基因的检测将更有助于儿童急性白血病的筛查，下一步本筛查体系将以此为基础进行完善。