基于matK+rbcL+trnH-psbA 联合分析法对罂粟属的植物鉴定

范豫杰 ，黄 磊 ，苏世达 ，苏少明

（1）云南省刑事科学技术重点实验室，云南 昆明 650221;2）昆明市公安局刑事科学技术研究所，云南 昆明 650506）

罂粟科全世界约有38 属700 余种，我国有18 属362 种，主要分布于我国的西南部和西北部[1-2]。紫堇属、绿绒蒿属、花菱草属与罂粟属同属于罂粟科，是近亲关系的植物。罂粟属中的不同种植物，又以虞美人（Papaver rhoeas.L）与罂粟最为相似。虞美人因其花朵鲜艳，有很高的观赏价值，被作为园林景观植物材料广泛应用[1,3]。

罂粟（Papaver somniferum.L）是“非法种植罂粟原植物罪”犯罪构成中的核心要件，明确种植对象是罂粟对定罪量刑十分重要。目前，罂粟的检验鉴定主要依据形态学，区别于传统主要依靠形态学的罂粟原植株鉴定方法，DNA 条形码技术不受个体形态、发育阶段的影响，通用性强、准确性高。DNA 条形码技术（DNA barcoding）是利用生物基因组中普遍存在的一段较短的、标准的DNA 序列作为分子标记，通过参考数据库同源比对，以及物种进化树来确定物种间的亲缘关系[4]。

因为罂粟被管制的特殊性，罂粟条形码DNA研究比较少，大多数研究直接使用Genbank 中的数据来筛选DNA 条形码[5]。由于Genbank 中数据来源的不确定，缺乏标准的鉴定规范，以及大量进口的特殊虞美人品种，都为罂粟检验鉴定的具体司法实践带来了诸多实际困难。罂粟的DNA 鉴定仍有巨大的研究空间，目前市面上也没有成熟可靠的罂粟DNA 试剂盒可供选择。本研究以5 种不同亚种的虞美人作为种内比对研究对象，将花菱草属的加州虞美人（花菱草）作为种间比对对象，从叶绿体基因序列psbA-trnH、matK 和rbcL 以及核糖体基因序列ITS 着手，拟探索一种可行的鉴定方法，为今后罂粟鉴定的规范作探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从安徽宿州植物培育基地、中国科学院武汉植物园、广州进口花卉园艺培植基地、成都花卉园艺培育基地处获得加州虞美人（Eschscholtzia californica Cham）、东方虞美人（Papaver Oriental.L）、沙地虞美人（Papaver ammophilum）、阿尔卑斯虞美人（Papaver alpinum）、塞浦路斯虞美人（Papaver cyprium）、冰岛虞美人（Papaver nudicaule）。从昆明市公安局禁毒支队处获得云南本土罂粟和新疆地区罂粟（Papaver somniferum.L）植株和种子，见表1。

表1 供试样本编号与分组Tab.1 Serial numbers of laboratory samples and section

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 DNA 的提取从上述8 种植物每种植株取其新鲜叶片，按植物种类混合，每种植物各取20 mg 干燥样本，加入液氮充分研磨，采用TSINGKE 植物DNA 提取试剂盒（普通版）提取植物DNA。

1.2.2 引物的来源在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找到相关序列，并用NCBI primerblast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）和Premier.5 软件设计出引物，见表2。

表2 扩增引物序列的设计Tab.2 The sequences of primer for amplification

1.2.3 PCR 扩增反应体系为50 µL 体系，Easy Taq Super Mix：45 µL，正向引 物：2 µL（浓 度10 µmol/L），反向引物：2 µL（浓度10 µmol/L），DNA 模板：1 µL。PCR 扩增条件：预变性：98 ℃，2 min；35 个循环（变性：98 ℃，10 s；引物退火：56 ℃，10 s；延伸：72 ℃，10 s）；终延伸：72 ℃，5 min；4 ℃延长保存。

1.2.4 测序分析用1%琼脂糖凝胶进行PCR 扩增产物电泳验证，对扩增产物委托擎科生物公司进行双向测序并对结果进行分析。通过Sequencing Analysis 5.2 分析峰图数据，最后判定数据是否可用，如果可用，结果保存为abi 格式和seq 格式。

1.2.5 测序结果处理测序良好的结果用ContigExpress 软件进行拼接，去除引物区域和低质量区域。使用MEGA X 计算K2P（Kimura 2-parameter）遗传距离，包括计算序列总体平均遗传距离（Average overall mean），种间平均遗传距离（Average between group distances）和种内平均遗传距离（Average within group distances）。使用MEGA X 构建N-J 发育树。

2 结果

2.1 扩增结果

使 用ITS2、ITS4、ITS5、rbcL、psbA-trnH、matK6 种引物序列对8 种植物样本DNA 进行扩增，冰岛虞美人（PNU）在ITS2、ITS4、ITS5 基因序列上均未获得产物。塞浦路斯虞美人（PCY）在rbcL和psbA-trnH 2 个基因序列上均未获得产物，见图1。

图1 ITS2、ITS4、ITS5、rbcL、psbA-trnH、matK 序列扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of ITS2ITS4ITS5 bcLpsbA-trnHmatK gene sequence amplification products

2.2 测序结果及信息位点评估

2.2.1 对ITS 序列的评估ITS 是rDNA 中介于18S 和5.8S 之间（ITS1），以及5.8S 和26S 之间（ITS2）的非编码转录间隔区，由于ITS1、ITS2 序列的进化速率快，常被用于植物种属内和种间亲缘关系的鉴定。本研究针对ITS4 和ITS5 重新设计的引物进行扩增测序。ITS4 和ITS5 的碱基序列长度大约是ITS2 的2 倍，碱基序列基本覆盖ITS2。测序结果分析发现ITS2、ITS4、ITS5 在东方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、塞浦路斯虞美人（PCY）样本中出现了双峰现象，见图3。考虑到本研究存在多个植株样本混合取样的情况，故采取了单株植物单独取样进行验证，同时对引物和扩增产物采取了PAGE 胶纯化，结果显示ITS 序列仍然存在双峰的现象，排除了污染的可能性。考虑到本实验测序采取双向测序，从峰形上看，以单峰为主，单峰和双峰混合出现，考虑为DNA 单链上存在碱基的缺失造成测序结果移码出现双峰、套峰，与ITS 序列本身变异有关。ITS 序列虽然容易产生变异，适合作为物种鉴定的后选基因序列，但同时变异也意味着存在大量的碱基突变和碱基缺失，碱基的突变和缺失容易给罂粟鉴定带来困难。

2.2.2 测序结果入库比对因东方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、塞浦路斯虞美人（PCY）的ITS4、ITS5 测序结果中存在双峰和套峰的情况，为保证入库比对准确性，表3 中仅展示了罂粟（PSL）、阿尔卑斯虞美人（PAL）的ITS4、ITS5 测序后入库比对的结果。表3 中还选取了测序成功率最高的叶绿体matK 测序结果入库进行比对。将ITS、matK 序列测序数据去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域，用ContigExpress 进行拼接，拼接结果在NCBI 里使用BLAST Analysis 功能进行比对校验，查看其与数据库里基因组测序结果之间的相似匹配情况，见表3。

表3 罂粟属植物的BLAST 比对结果Tab.3 BLAST comparison results of Papaver somniferum and its adulterants

2.2.3 遗传距离分析和构建发育树理想的DNA条形码，种内距离应明显小于种间距离。考虑到ITS2、ITS4、ITS5 两个基因序列存在双峰情况（图3），冰岛虞美人（PNU）在ITS 序列上出现扩增缺失，为保证遗传距离对计算分析准确性，本研究仅利用叶绿体基因进行发育树构建，而放弃利用ITS 的相关操作。

首先，本研究从Genbank 中下载了罂粟（Papaver somniferum.L，编号DQ912880）、冰岛虞美人（Papaver nudicaule，编号KF022360）、东方虞美人（Papaver Oriental.L，编号MH711392）、加州虞美人（Eschscholzia californica，编号Mk281585）的叶绿体psbA-trnH、matK 和rbcL 基因序列数据，通过3 个基因序列psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析，使用MEGA.X 软件计算种内、种间遗传距离，并构建N-J 系统发育树（图3）。根据psbAtrnH+matK+rbcL 联合分析显示种内平均遗传距离明显小于种间平均遗传距离（图4），以及N-J系统发育树对物种的区分度，表明psbA-trnH +matK+rbcL 联合分析方法有效。

图3 Genbank 中下载的数据进行psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析构建N-J 系统发育树Fig.3 The data downloaded from Genbank were analyzed by PSBA-TRNH +matK+rbcL to construct the N-J phylogenetic tree

图4 样本rbcL、psbA-trnH、matK 序列种内、种间平均遗传距离分布图Fig.4 The distribution of interspecific and intraspecific genetic distancebased on psbA-trnH+matK+rbcL sequences

其次，因塞浦路斯虞美人（PCY）在psbA-trnH、rbcL 两个基因序列上出现扩增无产物的现象，故不对塞浦路斯虞美人（PCY）进行N-J 建树分析。用MEGA X 软件对罂粟（PSL）、阿尔卑斯虞美人（PAL）、东方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、冰岛虞美人（PNU）、加州虞美人（ECC）使用psbAtrnH+matK+rbcL 联合分析法构建N-J 系统发育树邻接法分析序列矩阵所有的碱基作同等加权，空位采用缺失处理，邻接树上各分支的相对支持率采用bootstrap 进行1 000 次重复取样检验。结果（图5）显示，psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析能够很好地将罂粟与其他罂粟属植物区分开来，特别是能够将Genbank 中没有数据的沙地虞美人（PAM）与其他虞美人区分开。

图5 基于rbcL+psbA-trnH+matK 序列联合构建的 NJ系统发育树Fig.5 NJ phylogenetic tree based on psbA-trnH+matK+rbcL sequences

3 讨论

罂粟作为“非法种植毒品原植物罪”罪名成立的核心，能准确鉴定是否为罂粟植株对定罪量刑十分重要。如今虞美人作为观赏花卉大量出现在市面上，虞美人种类繁多，且属于罂粟科和罂粟属植物，在植物种子和幼苗阶段很难鉴别是否为罂粟。DNA 条形码技术为罂粟鉴定提供了新的方向。但由于罂粟被列为毒品被管制的特殊性，对其相关研究不多[6-24]。

3.1 直接使用Genbank 中的数据作为鉴定标准存在鉴定风险

目前，国内对罂粟DNA 条形码的研究多使用从Genbank 中直接下载数据分析。如张爽等[11]是通过从Genbank 中下载我国7 个罂粟属植物，进行数据分析后认为trnL-trnF 对国内罂粟属植物具有很好的区分效果。通过从数据库中下载数据，构建进化树和计算遗传距，对基因序列进行评估，来分析并筛选候选基因序列，该方法路径理论性强。但在实际工作中，直接使用Genbank 数据库中的数据作为鉴定标准，存在很大的鉴定风险。

对未知物种进行鉴定，必须要有物种鉴定的行业标准与参照，并用标准的操作获得稳定的结果。本次研究中通过实验数据入库比对后发现，如表3 所示，云南罂粟和新疆罂粟的ITS 序列经入库比对，最佳匹配物种均有虞美人（Papaver rhoeas）。本研究中的其他虞美人样本，ITS 序列入库比对，出现了与罂粟（Papaver somniferum）100%相匹配的情况；表3 叶绿体3 个基因序列中，沙地虞美人（PAM）的matK 基因序列与罂粟（PSL）100%相匹配；在psbA-trnH、rbcL 序列中，也都出现了虞美人与罂粟相匹配的现象。这对将Genbank 中的数据直接作为金标准来进行物种鉴别造成了阻碍。同时，无论使用UPGMA（类平均法）、ME（Minimum evolution，最小进化法）、NJ（Neighbor-joining，邻接法）或贝叶斯（Bayesian）推断等方法构建系统发育树的过程中，都有很多人为主观操作的环节，如对基因的剪切与整理，使用不同软件的算法等，都会对结果产生影响。

因此，从Genbank 中下载数据进行理论分析，并用于DNA 条形码的筛选的理论研究是可行的，但将其作为认定罂粟的金标准目前还存在巨大的鉴定风险。

3.2 单独使用ITS、psbA-trnH、rbcL、matK 序列无法区分罂粟属内植物

单独使用核基因组序列和叶绿体基因组序列对罂粟属内植物进行区分存在很大的鉴定风险。

罂粟条形码技术研究目前主要集中在ITS 序列，虽然ITS 核基因序列在其他中药领域有广泛的应用[13-14]，但就罂粟属内的植物来说，单独依靠一种基因序列进行测序后入库比对存在很大的鉴定风险。刘玮琦等[23]使用ITS4、ITS5 对疆罂粟属（Roemeria）、罂粟属（Papaver）、绿绒蒿属（Meconopsis）、海罂粟属（Glaucium）和蓟罂粟属（Argemone）构建N-J 发育树进行鉴定，显示结果理想。但本实验中使用ITS4、ITS5 对罂粟属内的罂粟和虞美人进行鉴定却存在很多困难。一方面是东方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、塞浦路斯虞美人（PCY）在ITS4、ITS5 中存在碱基缺失的现象，见图2；另一方面是冰岛虞美人（PNU）使用ITS4、ITS5 引物扩增后没有扩增产物。

图2 ITS 序列上大量的碱基突变与缺失Fig.2 A large number of base mutations and deletions in ITS sequence

单独用叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK 候选基因序列进行遗传距离分析和构建N-J 发育树也存在风险，市场上常见的塞浦路斯虞美人（PCY）在psbA-trnH、rbcL 基因序列没有扩增产物。

3.3 psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析能够有效将罂粟属内植物

本实验采用了叶绿体基因组条形码联合分析方法，针对罂粟属植物，即罂粟和市场上常见的各种虞美人开展了区分鉴定，取得了良好的效果。相关研究表明，组合条形码的分辨率普遍高于单一条形码，具有更高的普遍适用性[24]。本研究从Genbank 中下载了罂粟（Papaver somniferum.L）、冰岛虞美 人（Papaver nudicaule）、东方虞美人（Papaver Oriental.L）、加州虞美人（Eschscholzia californica）的叶绿体基因序列数据，通过对3 个基因序列psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析，构建种内、种间N-J 系统发育树，确定方法的有效性。然后将本研究中7 种植物（塞浦路斯虞美人以外）的叶绿体基因序列进行psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析，并构建N-J 系统发育树。经过对2 种发育树的比较，发现psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析能够有效将罂粟属内的植物进行区分。

3.4 关于罂粟的鉴定标准的展望

《中华人民共和国刑法》中，关于“非法种植毒品原植物罪”中的罂粟，按照中国植物志中的定义，应为罂粟（英文学名为Papaver somniferum.L）[1]。但在Genbank 中，能与Papaver somniferum.L在通用DNA 条形码基因序列上相匹配的虞美人品种却又有很多，这给司法实践关于鉴定标准的问题带来了很多的实际困难。罂粟的鉴定，其本身对定罪量刑十分关键，具有很强的司法实践意义。随着进口观赏物种的丰富，很多国外的观赏虞美人都含有吗啡、可待因、罂粟碱等成分，这些植物是否需要管制，是否应当被定义为罂粟，都需要检验鉴定的结论作为支撑。

本研究中发现，面对种类繁多复杂的虞美人品种，通过罂粟的核基因DNA 条形码ITS 序列对罂粟属内的植株进行区分存在困难。单独使用常用的叶绿体DNA 条形码，区分效果也不佳。而使用叶绿体psbA-trnH+matK+rbcL 联合分析能够针对本研究中的虞美人品种进行有效区分，这可以为今后制定罂粟DNA 鉴定行业标准提供一定的理论支持。

目前，我们国家没有自己的DNA 条形码数据库，很多研究都是将自己的测序结果录入国外数据库进行比较，得出相应的结论。建立我们国家的罂粟DNA 数据库和罂粟DNA 鉴定行业标准势在必行。只有从罂粟的概念、DNA 数据等方面建立行业标准和规范，方能为推进我们国家对“非法种植毒品原植物罪”的司法实践提供有效遵循。