乳酸利用菌的筛选及生长特性研究
2023-02-16毛志海殷想想方尚玲
毛志海，殷想想，占 成，常 煦，方尚玲
（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北省酿造工艺与装备工程技术研究中心，湖北武汉 430068；2.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000)
浓香型白酒是中国四大基础酒之一，典型特征就是采用泥窖固态发酵[1-2]。浓香型白酒经泥窖发酵、蒸馏、勾调而成，窖泥中微生物丰富是浓香型白酒酯类丰富的主要原因之一，己酸乙酯是酒体中主要的呈香物质，所以浓香型白酒以己酸乙酯为主体香[3]。乳酸乙酯也是浓香型白酒中最重要的呈香物质之一，浓香型白酒中含有适量的乳酸乙酯可以提高白酒的品质，过高或过低可能会导致浓香型白酒主体香味不突出和酒体粗糙[4]。
在白酒的酿造过程中，环境十分复杂，产乳菌产生过量的乳酸，导致酒体中乳酸含量过高，和乙醇发生酯化反应生成大量的乳酸乙酯，过量的乳酸乙酯是影响白酒风味和品质的重要指标[5-6]。乳酸乙酯性质稳定，一旦形成很难分解，所以只能减少乳酸乙酯的前体物质“乳酸”来达到降低乳酸乙酯的目的[7-8]。
本研究通过对老窖泥的筛选分离，筛选出能够利用乳酸的微生物。通过镜检、分子生物学方法对其进行鉴定，然后进行乙醇的耐受性、pH 的耐受性、葡萄糖存在条件下对乳酸的消耗情况研究，以期为将该菌株应用到白酒中打下基础，为浓香型或清香型白酒提高品质提供一定的帮助。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂及仪器
1.1.1 材料
窖泥：湖北省某酒厂优质窖泥。
1.1.2 培养基
乳酸钠培养基：1 %乳酸钠，1 %(NH4)2SO4，0.2 %酵母膏，0.5 %（NH4)2HPO4，配固体需要加入2%的琼脂。115 ℃灭菌20 min。
乳酸钠葡萄糖培养基：1 %乳酸钠，0.5 %葡萄糖，1 %(NH4)2SO4，0.2 %酵母膏，0.5 %（NH4)2HPO4。配固体需要加入2 %的琼脂，115 ℃灭菌20 min。
1.1.3 仪器设备
LRH-250生化培养箱，上海智城分析仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，浙江金坛市富华仪器有限公司；LDZX-50KBS 高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；2.5 L 厌氧培养袋，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；WFJ 2000 分光光度计，江苏海门市麒麟医用仪器厂；SBA-40D 传感分析仪，山东省科学院生物研究所；Thermo U3000 HPLC，赛默飞世尔科技公司。
1.2 试验方法
1.2.1 初筛
取10 g 窖泥放入90 mL 灭过菌的生理盐水中，振荡15 min，用纱布过滤，得到的过滤液进行梯度稀释（10-2、10-3、10-4、10-5），取每个稀释梯度液，使用涂布棒涂布于乳酸钠固体培养皿中，34 ℃培养24 h，挑选能在乳酸钠培养基上生长的微生物单菌落。
1.2.2 复筛
将挑取的单菌落涂布于乳酸钠固体培养皿中，每个挑取的单菌落至少划线3 次以上，得到的单菌落可以基本确定为能够利用乳酸的微生物，挑选单菌落进行镜检，观察其形态特征[9]。
1.2.3 优良乳酸利用菌的筛选
将复筛得到的6 株乳酸利用菌，接入乳酸钠培养液中活化24 h，按照5%的接种量，将6 株菌株分为2 组，分别接种到乳酸钠液体培养基中。1 组在恒温摇床中进行有氧培养，另一组在恒温培养箱中进行深层液体厌氧培养，每个组的菌株都在34 ℃下培养3 d，每个菌株做3个平行试验。
取每个菌株第1 d 和最后1 d 培养液各2 mL，使用高效液相色谱测样品中的乳酸含量，通过2 次乳酸差值计算出各菌株的乳酸利用量，选择对乳酸利用较好的菌株进行进一步试验。
1.2.4 优良乳酸利用菌发酵性能的测试
1.2.4.1 葡萄糖对乳酸利用菌的影响
白酒酿造过程中含有一定的葡萄糖，因此在葡萄糖存在的条件下利用乳酸是菌株作为乳酸利用菌的重要指标[10]。
将筛选得到的优良乳酸利用菌，接种到乳酸钠培养液中活化24 h，按照5%的接种量，将菌株活化培养液接种到乳酸钠葡萄糖液体培养基中，34 ℃培养条件下培养3 d，1 组进行有氧培养，1 组进行深层厌氧培养，每个菌株各做3 个平行。取第1 d和第3 d 发酵液各2 mL，使用高效液相色谱测发酵液乳酸含量和通过生物传感分析仪测发酵液葡萄糖含量。
1.2.4.2 优良乳酸利用菌pH值耐受性的测试
将乳酸利用较好的两株菌株进行活化，活化好的菌液分别按照5%的接种量，接种在pH值为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 的乳酸钠培养液中。在34 ℃恒温摇床中进行有氧培养3 d，每个梯度做3 个平行试验，从1 d 开始取样，每天取样2 mL，通过测定培养液的OD600值，判断菌株生长状态。
1.2.4.3 优良乳酸利用菌乙醇耐受性的测试
将优良乳酸利用菌活化好的培养液，按照5%的接种量，分别接种在含有不同浓度梯度乙醇（0%、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %）的乳酸钠培养液中[11]。在34 ℃恒温摇床中进行有氧培养3 d，每个梯度做3 个平行试验，从1 d 开始取样，每天取样2 mL，测培养液OD600的值。
1.2.5 发酵液分析方法
1.2.5.1 乳酸的测定方法
乳酸的测定采用高效液相色谱法[12]。样品处理：取100 μL 发酵液加入到900 μL 超纯水中稀释10 倍，用0.45 μm 有机滤膜过滤，将滤液装入进样瓶中进样。
1.2.5.2 葡萄糖含量的测定方法
葡萄糖含量[13]：使用生物传感仪进行测定。用葡萄糖标准液进行定标，将稀释10 倍后的样品，用微量进样器取25 μL注入生物传感仪测定。
1.2.5.3 样品菌液浓度的测定方法
使用分光光度计，用光密度（OD600值）表示样品菌液浓度。
1.2.6 优良耗乳菌的菌种鉴定
（1）试剂盒提取基因组DNA；（2）PCR 扩增16S rDNA：96 ℃预变性5 min，96 ℃变性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35 个循环，72 ℃保温10 min。PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状；（3）将PCR 产物送到华大基因测序。将测序结果进行NCBI-BLAST比对[14]。
2 结果与分析
2.1 乳酸利用菌的培养结果
将能够在乳酸钠培养基上生长的菌株，根据其菌落特征分为6 种不同类型的乳酸利用菌，初步命名为：R-0、R-1、R-2、R-3、R-4、R-5。见表1。
表1 筛选乳酸利用菌的菌落和镜检结果
从表1 可看出，6 株微生物的细胞都是杆状，菌落有所差异。R-0：菌落小、呈椭圆形、表面光滑；R-1：菌落大而粗燥、与培养基结合、不透明、菌落黄色；R-2：菌落小、湿润、表面光滑；R-3：菌落小、表面光滑、菌落呈浅黄色；R-4：菌落白色、小而光滑、边缘齐整；R-5：菌落呈白色、不透明、边缘呈花瓣状。
2.2 乳酸利用菌的筛选结果
培养基在灭菌过程中乳酸会有一定的挥发，所以样品灭菌接种后从0 d开始取样。
如表2 所示，在有氧且同样培养3 d 的条件下，6株菌株对乳酸的利用率基本都是100%。
表2 有氧培养3 d各菌株乳酸的消耗量
如表3 所示，在厌氧条件下，R-2 和R-3 菌株对乳酸的利用和其他菌株相比具有优势，R-2 和R-3对乳酸的利用率为12.9 %和16.0 %，R-0、R-1、R-4、R-5 对乳酸的利用率为10.4 %、12.0 %、7.1 %、10.6%。
表3 无氧培养3 d各菌株乳酸的消耗量
由以上结果分析得出，在有无氧条件下，6株微生物都可以利用乳酸，R-2 和R-3 菌株在厌氧条件下对乳酸的利用比其他菌株好。微生物在窖池的生长条件大部分都是厌氧的，因此选择R-2 和R-3在厌氧条件下利用乳酸最多的菌株进行下一步实验。
2.3 葡萄糖对乳酸利用菌的影响结果
如图1 所示，在有氧条件下，R-2 和R-3 分别利用乳酸2.16 g/L（28 %）和2.99 g/L（40 %），在相同的培养条件下，R-3 对乳酸的利用率比R-2 高12 %；在无氧条件下，R-2 和R-3 分别利用乳酸0.65 g/L（8.6 %）和0.73 g/L（9.7 %），R-3 对乳酸的利用率比R-2高1.1%。
图1 R-2和R-3有氧无氧下培养3 d乳酸的消耗量及利用率
如图2 所示，在有氧条件下，R-2 和R-3 各利用葡萄糖1.25 g/L（46%）和1.37 g/L（50.7%），R-3 对葡萄糖的利用率比R-2高4.7%；在无氧条件下，R-2 利用葡萄糖0.99 g/L（37 %），R-3 利用葡萄糖1.13 g/L（42 %），R-3 对葡萄糖的利用率比R-2 高5%。
图2 R-2和R-3有氧无氧下培养3 d葡萄糖的消耗量及利用率
由上所述，R-2 和R-3 在葡萄糖存在时同样可以利用乳酸，R-3 比R-2 在葡萄糖存在时对乳酸的利用更好。
2.4 pH值耐受性测的结果
如图3 所示，将R-2 和R-3 在34 ℃条件下培养3 d，R-3 菌株在初始pH 值为6.5、7.5、8.5 时，OD600值都随着时间的延长而上升，初始pH 值为8.5 时OD600值增长最高，R-3 菌株在初始pH 值为5.5 和9.5 时，OD600值随着时间的延长基本没有变化。这表明R-3 菌株可以在pH 值为6.5～8.5 的培养液中正常生长，最适pH为8.5。
图3 pH对菌株生长的影响
与R-3 菌株相比，R-2 菌株只有在初始pH 值为5.5 时OD600值基本不变，在初始pH 值为6.5、7.5、8.5、9.5 时，OD600值都随着时间的延长一直上升，特别是在初始pH 值为8.5 时OD600值增长最高，这表明R-2 菌株可以生长的pH 值范围是6.5～9.5，最适生长pH值为8.5。
综上所述，R-2和R-3菌株可以正常生长的pH值范围为6.5～9.5。据报道，窖泥中的pH 值在5.86～9.22 范围内变化，完全符合这两株乳酸利用菌对pH值的生长需求[15-17]。
2.5 乙醇耐受性结果
将R-2 和R-3 菌株接种于含有乙醇浓度为0 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %的乳酸钠培养基中，34 ℃下有氧培养3 d，结果如图4所示。
图4 乙醇浓度对菌株生长的影响
R-3 菌株在接种后就进入对数生长期，R-2 菌株在1 d 时才开始进入对数生长期；R-2 和R-3 菌株在乙醇含量为0 %～4 %时，OD600值都可以快速增长；在乙醇含量为5%时，2 菌株受乙醇的抑制较为明显，OD600值增长较为缓慢。2 菌株在乙醇含量为0%～4%可以快速生长，与镇达等[18]研究6 株乳酸利用菌对乙醇的耐受性结果基本一致。
结果表明，2 菌株都可以耐受5 %以下的乙醇含量，R-3 比R-2 菌株能更快进入对数生长期，说明R-3比R-2菌株能够更快适应生长环境。
2.6 菌种鉴定结果
R-3 和R-2 菌株的16S rDNA 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图5 所示，孔号1 是R-3 菌株，孔号2 是R-2 菌株，测序结果在Genbank 数据库进行比对，R-2 为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.），R-3为热带杆菌（Bacillus tropicus）。
由图5 可知，R-2 和R-3 菌株经过PCR 扩增得到了高质量的扩增产物，将扩增产物测序，选取相似度高的比对结果使用MEGA6 软件构建系统发育树，结果如图6所示。
图5 R-3和R-2菌株的16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果
由图6 可知，R-2 菌株与芽孢杆菌相似度最高，R-3菌株与热带杆菌相似度最高。
图6 R-2和R-3菌株的系统发育树
3 结论
通过对老窖泥的分离筛选，得到了6 株能够利用乳酸的菌株。选择R-2 和R-3 这两菌株在厌氧条件下对乳酸利用较好的微生物进行研究。经分子生物学鉴定R-2 为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.），R-3 为热带杆菌（Bacillus tropicus），R-2 和R-3 菌株在34 ℃都可以耐受5%的乙醇含量，R-2菌株pH 生长范围是6.5～8.5，R-3 菌株pH 生长范围是6.5～9.5，最适生长pH 都是8.5；在葡萄糖存在时两菌株仍然可以利用乳酸，有氧时，R-3 对乳酸的利用率比R-2 高12 %，厌氧时，R-3 对乳酸的利用率比R-2 高1.1%。两菌株对白酒降低乳酸乙酯有一定的应用与参考价值。
