NLRP3炎症小体：缺血性脑卒中的潜在治疗靶点

张 朋， 韩荣荣综述， 张爱梅审校

缺血性脑卒中发生后的病理生理过程非常复杂，包括炎症反应、酸中毒、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、血脑屏障破坏、胶质细胞活化和补体激活等。上述病理过程相互作用，形成正反馈调节，进一步加重神经细胞死亡和脑组织损伤[1]。目前，临床上公认的治疗急性缺血性脑卒中的有效手段包括静脉溶栓和血管内取栓[2]。然而，除了严格的时间窗限制外，静脉溶栓和血管内取栓均面临一个重要问题，那就是血管再通后由炎症反应引起的缺血再灌注损伤。因此，如何尽可能减轻缺血性脑卒中后的神经炎症是临床上亟待解决的问题。

近年来，人们对信号通路中的炎症小体的关注与日俱增，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体是最早发现的炎症小体之一，它是检测脑卒中后细胞损伤以及介导脑卒中后神经炎症的关键介质[3，4]。针对NLRP3炎症小体及其上下游通路的调控可能为缺血性脑卒中提供新的治疗策略。因此，本文对NLRP3炎症小体的结构、激活、组装和调控做一综述并着重介绍NLRP3炎症小体在缺血性脑卒中治疗中的潜在靶点和国内外最新研究进展。

1 NLRP3炎症小体

1.1 NLRP3炎症小体的结构 NLRP3炎症小体主要表达于巨噬细胞、神经细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等这些细胞的胞浆中，由以下三种成分组成：NLRP3受体蛋白、凋亡相关斑点样蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)，这三种蛋白相互作用，共同调节炎症小体的功能[5]。NLRP3受体蛋白属于NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)家族的蛋白质成员，由人类的22个基因家族编码，是最典型的炎症小体传感器分子。NLRP3受体蛋白由三个结构域组成，包括一个位于中央的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT)，一个氨基末端的热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)和一个羧基末端的亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，羧基末端的LRR结构域主要参与识别刺激，中央的NACHT结构域主要介导自身寡聚，氨基末端的PYD主要与下游同型蛋白结合。ASC由两个相互作用结构域组成，包括氨基末端的PYD和羧基末端CARD。Pro-caspase-1包括CARD(与ASC尾端的CARD结合)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶结构域(caspase)。在外界刺激因子的作用下，NLRP3受体蛋白、pro-caspase-1和ASC组装成NLRP3炎症小体，进而诱发一应系列炎症反应[5～8]。

1.2 NLRP3炎症小体的激活和组装 NLRP3炎症小体的激活由以下两个阶段组成：第一阶段为启动阶段，由病原相关分子模式和损伤相关分子模式的识别所诱导[9]。通过激活核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路，促进NLRP3、白介素1β前体(pro-Interleukin-1β，pro-IL-1β)和白介素18前体(pro-Interleukin-18，pro-IL-18)等蛋白的表达[10]。第二个阶段为激活阶段，是由组织损伤、感染或代谢失衡等一系列刺激诱导。在这一阶段，K+外流、Na+内流、溶酶体损伤、活性氧的生成以及线粒体功能障碍等刺激均可促进NLRP3炎症小体的组装[11]。

NLRP3炎症小体的组装是通过NLRP3受体蛋白的PYD和ASC的PYD相互作用而启动的[12]。在感知到危险信号后，NLRP3单体发生寡聚并通过与ASC的PYD相互作用而募集ASC，进而形成一个大的斑点结构[7]。在形成斑点结构后，pro-caspase-1通过CARD-CARD相互作用被募集，并通过CARD-caspase接头区域的切割而被激活[13]。至此，级联激活的NLRP3/ASC/caspase-1多蛋白复合体，即NLRP3炎症小体组装完毕。具有生物活性的caspase-1将促炎细胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18分别切割为成熟的IL-1β和IL-18，随后这些成熟的细胞因子被分泌到细胞外发挥促炎作用，同时，caspase-1可以解离消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)，释放其活性N-末端片段，GSDMD的N-末端片段与细胞膜中的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇磷酸结合，形成一个1020 nm的孔隙，并触发一种裂解形式的细胞死亡，称为细胞焦亡，进而促进成熟的IL-1β和IL-18分泌到细胞外，最终诱发更广泛、更强烈的炎症反应[14](见图1)。

2 基于NLRP3炎症小体治疗缺血性脑卒中的相关药物及其机制

越来越多的证据表明NLRP3炎症小体介导缺血性脑卒中后的神经炎症反应，这里我们总结了几种针对NLRP3炎症小体治疗缺血性脑卒中的药物及其相关调控机制(见图1、表1)。

表1 药物干预NLRP3炎症小体治疗缺血性脑卒中的国内外研究进展

注：NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；pro-caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前体；PYD：热蛋白结构域；NACHT：核苷酸结合寡聚化结构域；LRR：亮氨酸重复序列；CARD：凋亡相关斑点样蛋白；caspase：天冬氨酸蛋白酶结构域；NF-κB：核因子-κB；TXNIP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；AMPK/GSK-3β：腺苷酸活化蛋白激酶/糖原合成酶激酶3β；GSDMD：消皮素D；procyanidins：原花青素；PAEs：纯化的花青素提取物；immunoproteasome：免疫蛋白酶体；APNp：脂联素肽；Hispidulin：高车前素；Evs：细胞外囊泡；Z-GS：香胶甾酮；ROS：活性氧；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-18：白细胞介素-18

2.1 NLRP3炎症小体小分子抑制剂 MCC950是NLRP3炎症小体的特异性抑制剂，Saifudeen等人证明MCC950对小鼠短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型有神经保护作用，与对照组相比，使用MCC950处理的实验组小鼠可显著降低脑卒中后脑梗死以及脑水肿体积，并且降低了半暗带区NLRP3炎症小体裂解产物caspase-1以及IL-1β的表达[15]。另外一项动物实验表明，使用小鼠tMCAO模型模拟脑缺血再灌注损伤，发现NLRP3炎症小体主要在缺血侧神经元中表达并且诱导驱动了急性缺血性脑卒中后的神经炎症反应，NLRP3炎症小体的上调发生在缺血性脑卒中的早期，对应于人类缺血性脑卒中的超急性期和急性期，使用MCC950阻断NLRP3炎症小体可以减轻炎症和稳定血脑屏障，进而减轻缺血再灌注损伤[16]。以往的研究认为，水通道蛋白-4调节脑组织中水分子的转运，内皮素-1诱导脑水肿。一项动物实验表明，在小鼠tMCAO模型中，实验组小鼠腹腔注射MCC950，检测脑组织中NLRP3、IL-1β、IL-18、GSDMD、水通道蛋白-4、内皮素-1的变化，结果发现NLRP3炎症小体促进小鼠脑组织水肿以及血脑屏障破坏，腹腔注射MCC950可以降低水通道蛋白-4和内皮素-1的水平以及调节水通道蛋白-4在梗死区的表达和分布。因此，NLRP3炎症小体可能也是治疗脑缺血再灌注后脑组织水肿的重要靶点[17]。综上，MCC950作为NLRP3炎症小体的特异性抑制剂可能是一种很有前途的治疗药物，可以在脑血管闭塞以及再通后的缺血再灌注期间抑制炎症反应，但MCC950的治疗效果和方案有待进一步研究，以确定其是否有希望成为临床试验的候选者，并且目前还没有临床批准的针对NLRP3炎症小体的特异性抑制剂，然而，有研究支持通过Bruton酪氨酸激酶抑制剂伊布替尼(PCI-32765)靶向抑制NLRP3炎症小体的观点，这或许能为缺血性脑卒中相关炎症提供新的治疗手段[18]。

2.2 NLRP3炎症小体与自噬诱导剂 自噬是溶酶体参与的一种高度保守的分解代谢途径[19]，既往的研究表明，自噬活性可以通过清除缺血脑组织产生的线粒体DNA和线粒体活性氧来抑制NLRP3炎症小体的激活以及IL-1β的表达，进而减轻脑缺血再灌注损伤[20]。因此，自噬诱导治疗的有效性受到许多学者的关注，近年来，一些研究探讨了自噬诱导剂对NLRP3炎症小体调控的作用以及与缺血性脑卒中的关系。

最近的一项体外实验发现，采用BV2型小胶质细胞氧-糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型模拟缺血性脑损伤，结果发现京尼平苷可降低小胶质细胞OGD/R模型中NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β的水平，而自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达增加，表明京尼平苷能显著减轻OGD/R后BV-2型小胶质细胞诱导的炎症反应，其具体机制可能是通过促进自噬活性进而抑制NLRP3炎性小体的表达来实现神经保护作用的[21]。另有研究表明，使用小胶质细胞特异性过表达过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)的转基因小鼠诱导tMCAO模型，观察过表达PGC-1α小胶质细胞的形态学表现和基因表达谱以及NLRP3炎症小体的激活和下游炎性因子的产生情况，采用染色质免疫沉淀-测序技术检测小胶质细胞中PGC-1α的结合位点，通过对UNC-51样激酶1(unc-51 like kinase 1，ULK1)的药物抑制和基因组敲除来评估ULK1在缺血性脑卒中后介导的线粒体自噬作用，结果表明PGC-1α通过ULK1促进自噬以及线粒体自噬活性，反过来，这个过程又进一步抑制了由NLRP3炎症小体介导的炎症反应[22]。有研究证明，糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是导致脑缺血再灌注损伤的重要危险因素[23]，在许多疾病中均可抑制自噬活性。采用大鼠MCAO/R模型模拟大鼠脑缺血再灌注损伤，使用GSK-3β的化学抑制剂SB216763或者GSK-3βsiRNA抑制GSK-3β在体内的激活和表达，结果发现抑制GSK-3β可通过增强自噬活性而抑制NLRP3炎症小体的表达[24]。Luo等人证明，在大鼠tMCAO模型中，6-姜辣素通过TRPV1/FAF1复合体的解离诱发自噬进而抑制NLRP3炎症小体的活化来减轻缺血再灌注损伤[25]。以上表明脑缺血后自噬活性被显著激活且与神经炎症反应密切相关，自噬是负性调控NLRP3炎症小体活化的重要因素。缺血性脑卒中后通过诱导自噬激活，下调NLRP3/ASC/caspase-1级联反应信号通路，从而抑制NLRP3炎症小体，进而减轻脑缺血后的炎症反应。

虽然目前关于自噬与缺血性脑卒中的研究较少，但大量研究表明自噬和NLRP3炎症小体在神经系统疾病中发挥重要作用。因此，自噬诱导剂的研发可能是缺血性脑卒中后NLRP3炎症小体介导神经炎症的潜在治疗方向，但其具体机制仍需进一步研究。

2.3 其他参与调控NLRP3炎症小体信号通路的药物及其作用机制

2.3.1 通过TLR4/NF-κB/NLRP3途径调控NLRP3炎症小体的药物 原花青素是从葡萄籽中提取的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[26]。在以右侧颈总动脉闭塞法诱导的大鼠tMCAO模型中[27]，原花青素于大鼠MCAO前1 h灌胃给药，结果发现原花青素能显著改善大鼠MCAO/R所致的神经功能缺损以及减轻脑水肿和减少脑梗死体积。在体内外实验中，原花青素还能显著抑制TLR4-p38-NF-κB-NLRP3信号通路的激活以及抑制MCAO/R和OGD/R诱导的IL-1β等炎性细胞因子的释放，表明原花青素可能通过抑制TLR4-p38-NF-κB-NLRP3信号通路对脑缺血再灌注损伤产生神经保护作用。另有研究表明，在小鼠tMCAO模型模拟脑缺血再灌注损伤模型中，使用纯化的花青素提取物(purified anthocyanin extracts，PAEs)治疗tMCAO小鼠1周后，测定小鼠脑梗死体积、脑损伤程度以及超氧化物歧化酶等指标，发现PAEs对小鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与TLR4/NF-κB和NRFP3信号通路有关[28]。最近的一项研究证明，在体内外脑缺血模型中，抑制免疫蛋白酶体可以降低NLRP3受体蛋白、ASC、caspase-1、IL-1β以及IL-18等NLRP3炎症小体相关蛋白的表达，并且降低了NF-κB、焦亡相关蛋白的水平；此外，在细胞OGD/R模型中，使用NF-κB小分子抑制剂BAY-11-7082可降低NLRP3炎症小体和caspase-1的表达，提示免疫蛋白酶体可能通过NF-κB途径诱导NLRP3炎症小体的表达和激活[29]。

2.3.2 通过AMPK/GSK3β/NLRP3途径抑制NLRP3炎症小体的药物 腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是细胞能量调节的关键酶，越来越多的证据表明，AMPK激活剂可在多种炎症损伤中发挥抗炎保护效应。最近的研究表明脂联素肽(Adiponectin peptide，APNp)通过调节AMPK/GSK-3β信号通路减轻脑缺血再灌注后ROS/Trx1/TXNIP相关的氧化应激以及抑制NLRP3炎症小体的激活，同时发现APNp对NLRP3炎症小体的激活是以依赖AMPK的方式实现的，提示APNp在治疗缺血性脑卒中方面有很大的临床应用潜力。然而，值得关注的是，实验中发现APNp与其受体脂联素受体-1在大多数星形胶质细胞中有共定位现象，提示APNp的抗炎作用可能是通过作用于星形胶质细胞实现的[30]。此外，有研究报道高车前素也可以通过调节AMPK/GSK3β信号通路，抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤，因此，高车前素可能是针对缺血性脑损伤的一种神经保护剂[31]。

2.3.3 通过TXNIP/NLRP3通路抑制NLRP3炎症小体的药物 在一项使用OGD/R和tMCAO模型分别模拟体内外脑缺血再灌注损伤的细胞和动物模型中，发现microRNA-135a-5p在M2型小胶质细胞来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)中高表达，M2型小胶质细胞可以介导microRNA-135a-5p进入神经细胞，通过抑制硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表达，进一步抑制NLRP3炎症小体的激活，从而减轻脑缺血再灌注损伤[32]。过氧化物酶体增殖物激活受体-β/δ激动剂GW0742已被证实在多种疾病中具有抗炎作用，Marcin Gamdzyk等人证明，在大鼠缺血缺氧(hypoxia-ischaemia，HI)模型和细胞OGD模型中，GW0742可以抑制由TXNIP/NLRP3途径介导的神经炎症[33]。香胶甾酮(Z-Guggulsterone，Z-GS)是一种类固醇化合物，现已被证明对动脉粥样硬化、高脂血症和癌症等多种疾病有效[34]。在一项以大鼠MCAO模型探讨Z-GS对缺血性脑卒中具体作用机制的研究中，使用微阵列分析，共鉴定出8276个差异表达基因，随后通过趋势分析筛选出TXNIP和NLRP3为潜在的靶基因。此外，Z-GS还成功地抑制了OGD神经元模型的氧化应激和炎症反应，TXNIP基因敲除可显著降低OGD诱导的神经元中NLRP3炎症小体的表达。因此，Z-GS通过抑制TXNIP/NLRP3轴减轻缺血性卒中后的氧化应激和炎症反应，从而发挥神经保护作用，有望成为未来治疗缺血性脑卒中的候选药物[35]。

3 结局及展望

综上所述，NLRP3炎症小体是介导缺血性脑卒中后炎症反应的关键媒介。越来越多的证据表明，从不同水平抑制NLRP3炎症小体的活化可显著减少脑梗死体积和改善预后。NLRP3炎症小体的发现为研究缺血性脑卒中的分子机制提供了新的途径，从不同水平调控NLRP3的组装、表达和激活可能为挽救缺血半暗带和改善缺血脑卒中后神经功能恶化提供新的思路。然而，目前NLRP3炎症小体与缺血性脑卒中的研究大多集中在动物模型及体外实验，靶向抑制NLRP3炎症小体是否对人体有效以及何时启动靶向治疗，仍需大量的实验和临床验证。相信随着NLRP3炎症小体激活机制研究的不断深入，缺血性脑卒中的治疗会迎来新的机遇。