基于层次分析法的正交试验优选坐浴安散提取工艺*

覃 翔 ，李婉铭 ，韦金彩 ，廖 强

（1. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011； 2. 广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530011； 3. 广西壮族自治区南宁市食品药品检验所，广西 南宁 530004）

坐浴安散是广西中医药大学附属瑞康医院研发的中药制剂（桂药制字Z20050001），由大黄、功劳木、苦参、五倍子、两面针等中药组方，具有清热解毒、消肿止痛功效，用于治疗内外痔发炎、痔瘘术后肛瘘肿痛，临床疗效显著。方中，大黄、功劳木清热解毒、活血化瘀，苦参清热燥湿、杀虫止痒，五倍子、白矾、芒硝、冰片收敛消肿、止血止痒，配以两面针消肿止痛效果更佳［1-2］。现代药理学研究表明，大黄含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、有机酸类等化合物［3］。其中，主要药效成分为蒽醌类化合物，包括结合型和游离型，结合型蒽醌可溶于热水，几乎不溶于冷水，游离型蒽醌难溶于水，均易溶于丙酮、甲醇、乙醇。功劳木主要含有小檗碱、巴马汀、氧化小檗碱、尖刺碱、阿莫灵等生物碱类化合物［4］。苦参主要含有生物碱类、黄酮类、氧杂蒽酮类、醌类、三萜糖苷、脂肪酸和挥发油［5］。五倍子的主要成分为鞣酸［6］。两面针主要含有生物碱类、木脂素类有效成分［7］。根据处方中需提取的5味药材有效成分的理化性质，本研究中采取醇水双提法，先用乙醇提取大黄，再将醇提后的药渣与另外4味药材（功劳木、苦参、五倍子、两面针）一同用水进行提取，最大限度地富集有效成分。采用高效液相色谱（HPLC）法测定6 种指标成分的含量，以醇提物中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量与醇提干膏得率为醇提工艺的综合评价指标，以水提物中苦参碱、氧化苦参碱、盐酸小檗碱的含量与水提干膏得率为水提工艺的综合评价指标，通过层次分析（AHP）法建立指标回归模型，确定各指标权重系数，以正交试验优选醇提及水提工艺，为坐浴安散的提取工艺确立提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030（Plus）型高效液相色谱仪，配有真空脱气机、四元泵、自动进样器、紫外（UV）检测器（日本岛津公司）；VGT - 2227QTD 型超声波清洗机（广东固特超声股份有限公司，功率为600 W，频率为40 kHz）；xs205du型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；101-38型数显式电热恒温干燥箱（上海沪越实验仪器有限公司）；GM - 0.33A 型隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 试药

大黄（批号为20210406），功劳木（批号为20201030），苦参（批号为20210316），五倍子（批号为20210316），均购自广西柳州百草堂中药饮片厂有限责任公司；两面针（广西德润堂中药科技有限公司，批号为20200901）。以上中药饮片经广西壮族自治区南宁市食品药品检验所副主任药师廖强鉴定均符合2020 年版《中国药典（一部）》规定。大黄酸对照品（批号为110757-201607，含量为99.3%），大黄素对照品（批号为110756-201913，含量为96.0%），大黄酚对照品（批号为110796- 201922，含量为99.4%），盐酸小檗碱对照品（批号为110713 -202015，含量为85.9%），苦参碱对照品（批号为110805-202010，含量为98.7%），氧化苦参碱对照品（批号为110780 - 201909，含量为92.9%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司），其他试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 多指标含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。

醇提物大黄酸、大黄素、大黄酚：甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5 min 时70%A，5～8 min 时 70%A → 85%A，8～20 min 时85%A，20～25 min 时 85%A → 70%A，25～30 min 时70%A）；检测波长为254 nm。理论板数按大黄素峰计应不低于3 000。

水提物苦参碱、氧化苦参碱：乙腈为流动相A，0.025 moL/ L 磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱（0～10 min 时 2%A → 8%A，10～15 min 时 8%A，15～20 min 时 8%A → 2%A，20～25 min 时 2%A）；检测波长为220 nm。理论板数按氧化苦参碱峰计应不低于4 000。

水提物盐酸小檗碱［8］：乙腈为流动相A，0.05 moL/L磷酸二氢钾溶液（加0.2%三乙胺，用磷酸调pH 至3）为流动相B，梯度洗脱（0～8 min 时22%A → 30%A，8～12 min 时 30%A → 50%A，12～18 min 时 50%A，18～22 min 时 50%A → 30%A，22～25 min 时 30%A →22%A，25～30 min 时22%A）；检测波长为345 nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计应不低于5 000。

2.1.2 溶液制备

分别取大黄酸、大黄素、大黄酚、苦参碱和氧化苦参碱对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为 26.18，24.24，26.18 µg/ mL 的大黄酸、大黄素、大黄酚混合对照品溶液Ⅰ及质量浓度分别为58.14，158.75µg/mL 的苦参碱、氧化苦参碱混合对照品溶液Ⅱ。取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加盐酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）溶解，制成质量浓度为11.38µg/mL的对照品溶液Ⅲ。

取坐浴安散醇提物干膏粉末（过4 号筛）0.03 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为600 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理（功率为600 W，频率为40 kHz）2 min，加二氯甲烷10 mL，加热回流1.0 h，放冷，置分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗涤容器，置分液漏斗中，分取二氯甲烷层，酸液用二氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并二氯甲烷液，减压干燥至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，0.45µm 微孔滤膜滤过，即得醇提物大黄酸、大黄素、大黄酚供试品溶液［9］。

取坐浴安散水提物干膏粉末（过4 号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液2 mL，精密加入二氯甲烷50 mL，称定质量，超声处理（功率为600 W，频率为40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用二氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣加70%甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，0.45µm 微孔滤膜滤过，即得水提物苦参碱、氧化苦参碱供试品溶液［10］。

取坐浴安散水提物干膏粉末（过4 号筛）0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸- 甲醇溶液（1∶100，V/V）50 mL，称定质量，超声处理（功率为600 W，频率为40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用盐酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣加盐酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加盐酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）定容，摇匀，0.45µm 微孔滤膜滤过，即得水提物盐酸小檗碱供试品溶液。

分别按处方比例称取除苦参外的其他药材和除功劳木外的其他药材各1份，以及各自水提后得到的干膏粉末（过4 号筛），精密称定，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：吸取2.1.2项下混合对照品溶液Ⅰ，Ⅱ，对照品溶液Ⅲ和供试品溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，大黄酸、大黄素、大黄酚、苦参碱、氧化苦参碱、盐酸小檗碱与各杂质峰分离度均较好，各待测成分的理论板数均符合要求。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液Ⅰ，Ⅱ和对照品溶液Ⅲ各1，2，4，6，8，9 mL，置10 mL容量瓶中，2 种混合对照品溶液用甲醇稀释并定容，对照品溶液Ⅲ用盐酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）稀释并定容，摇匀，即各得6 个梯度对照品溶液，按2.1.1 项下色谱条件分别进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度为（X，µg/mL）横坐标进行线性回归。结果见表1，表明所测成分在各自的质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.1.2 项下混合对照品溶液Ⅰ，Ⅱ和对照品溶液Ⅲ各适量，以各自配制所用溶剂稀释2 倍，作为混合对照品溶液a、混合对照品溶液b 和对照品溶液c。取上述3 种溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果见表1，表明仪器精密度良好。

重复性试验：分别取同一批坐浴安散醇提物和水提物干膏粉末各适量，精密称定，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液6 份，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算平均含量。结果见表1，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下供试品溶液各适量，分别于室温下放置 0，2，4，6，8，10 h 时按 2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表1，表明供试品溶液在室温下10 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知大黄酸、大黄素、大黄酚含量的坐浴安散醇提物干膏粉末6份，每份0.01 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加混合对照品溶液Ⅰ（大黄酸、大黄素、大黄酚质量浓度分别为 26.18，24.24，26.18 µg/ mL）10 mL，加甲醇定容，按2.1.2项下“醇提物大黄酸、大黄素、大黄酚”中自“称定质量”起制备6 份加样供试品溶液；取已知苦参碱、氧化苦参碱含量的坐浴安散水提物干膏粉末6 份，每份0.2 g，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加混合对照品溶液Ⅱ（苦参碱、氧化苦参碱质量浓度分别为58.14，158.75 µg/ mL）2 mL，加二氯甲烷定容，按2.1.2项下“水提物苦参碱、氧化苦参碱”中自“称定质量”起制备6 份加样供试品溶液；取已知盐酸小檗碱含量的坐浴安散水提物干膏粉末6 份，每份0.05 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加对照品溶液Ⅲ（盐酸小檗碱质量浓度为11.38µg/mL）2 mL，加盐酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）定容，按2.1.2 项下“水提物盐酸小檗碱”中自“称定质量”起制备6 份加样供试品溶液。上述加样供试品溶液分别按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算加样回收率。结果见表1，表明方法准确度良好。

表1 方法学考察结果（n=6）Tab.1 Results of the methodological investigation（n=6）

2.1.4 含量计算

醇提物中大黄酸、大黄素、大黄酚含量按以下公式计算其含量。含量（mg/g）=［供试品溶液中待测成分质量浓度（µg/mL）×供试品溶液总体积（mL）×25］/［供试品取样量（g）×5×1 000］。

水提物中苦参碱、氧化苦参碱、盐酸小檗碱含量按以下公式计算其含量。含量（mg/g）=［供试品溶液中待测成分质量浓度（µg/mL）×供试品溶液总体积（mL）］/［供试品取样量（g）×1 000］。

2.2 提取物干膏得率计算［11］

精密吸取坐浴安散醇/水提取液适量，置干燥的恒定质量蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱中干燥3.0 h，取出，干燥器中冷却20 min，迅速称定质量，按以下公式计算干膏得率。干膏得率（%）=（干膏质量×样品总体积）/（饮片质量×取样体积）×100%。

2.3 AHP 法确定各指标权重系数

根据中药复方君臣佐使配伍关系及各成分药理作用强弱，参考文献［12］，确定醇提工艺各指标的优先顺序为大黄酸含量=大黄素含量=大黄酚含量>醇提干膏得率，水提工艺各指标的优先顺序为盐酸小檗碱含量> 苦参碱含量= 氧化苦参碱含量> 水提干膏得率。本研究中结合正交试验将评价系统设计为3层，绘制优化层次结构模型（图2）。采用1～9 标度法对4 项指标进行两两比较评判重要性，按几何平均法计算各指标的权重系数。各指标两两比较的评分标准见表2，醇提/水提工艺优先矩阵判断见表3和表4。

图2 坐浴安散工艺优化层次结构模型Fig.2 Hierarchical structure model for process optimization of Zuoyu” an Powder

表2 各指标两两比较评分标准Tab.2 Scoring criteria for pairwise comparison of various indexes

表3 醇提工艺指标成对比较的优先矩阵判断Tab.3 Precedence matrix judgment of pairwise comparison of various indexes in the alcohol extraction process

表4 水提工艺指标成对比较的优先矩阵判断Tab.4 Precedence matrix judgment of pairwise comparison of various indexes in the water extraction process

使用AHP 分析V1.82_10.82 版软件（南京迈实软件有限公司）计算，求得大黄酸、大黄素、大黄酚含量和醇提干膏得率的权重系数分别为0.312 5，0.312 5，0.312 5，0.062 5，矩阵的最大特征值（λmax）=4，一致性指标（CI）=0；盐酸小檗碱、苦参碱、氧化苦参碱含量和水提干膏得率的权重系数分别为0.520 5，0.201 0，0.201 0，0.077 6，矩阵的λmax=4.043 38，CI=0.014 460 5。随机一致性比率（CR）是衡量所得权重系数是否合理的重要指标，CR=CI/RI，当CR<0.1 时可判断矩阵具有满意的一致性及权重计算正确性。本研究中醇提和水提工艺的CR分别为0 和0.016 244 7，均小于0.1，表明4 项指标优先比较矩阵满足一致性要求，权重系数合理、有效，可用于坐浴安散醇提和水提工艺的综合评分［13-14］。

2.4 提取工艺综合评分

分别计算各指标成分的含量及醇提/水提工艺的干膏得率，结合2.3项下确定的权重系数计算提取工艺综合评分。醇提工艺综合评分=［（大黄酸含量/大黄酸含量最大值）×0.312 5+（大黄素含量/大黄素含量最大值）×0.312 5+（大黄酚含量/大黄酚含量最大值）×0.312 5 +（醇提干膏得率/ 醇提干膏得率最大值）×0.062 5］×100；水提工艺综合评分=［（盐酸小檗碱含量/盐酸小檗碱含量最大值）×0.520 5+（苦参碱含量/苦参碱含量最大值）×0.201 0+（氧化苦参碱含量/氧化苦参碱含量最大值）×0.201 0+（水提干膏得率/水提干膏得率最大值）×0.077 6］×100。

2.5 正交试验优选提取工艺

2.5.1 醇提工艺单因素考察

乙醇体积分数：称取等量醇提药材饮片5 份，每份各加相当于饮片8 倍量的50%，60%，70%，80%，90%乙醇，分别提取1 次，每次40 min，计算5 份提取物的综合评分。结果见图3 A，表明固定其他条件不变，乙醇体积分数为60%，70%，80% 时提取物的综合评分较高。

溶剂用量：称取等量醇提药材饮片5 份，每份各加相当于饮片4，6，8，10，12倍的70%乙醇，分别提取1次，每次40 min，计算5份提取物的综合评分。结果见图3 B，表明固定其他条件不变，溶剂用量在8，10，12倍时提取物的综合评分较高。

提取时间：称取等量醇提药材饮片5 份，每份各加相当于饮片8 倍量的70%乙醇，分别提取1 次，分别提取10，20，40，60，90 min，计算5 份提取物的综合评分。结果见图3 C，表明固定其他条件不变，提取时间为20，40，60 min时提取物的综合评分较高。

图3 醇提工艺单因素多水平考察结果Fig.3 Results of single - factor and multi - level investigation of alcohol extraction process

提取次数：称取等量醇提药材饮片4 份，每份各加相当于饮片 8 倍量的 70% 乙醇，分别提取 1，2，3，4 次，每次40 min，计算4份提取物的综合评分。结果见图3 D，表明固定其他条件不变，提取物综合评分随提取次数的增加而增加，但提取3 次后增长幅度很小，已接近提取完全，故选择提取次数为1，2，3次。

2.5.2 水提工艺单因素考察

加水量：按处方比例称取等量水提药材饮片5 份，每份各加相当于饮片4，6，8，10，12 倍的水，分别提取1 次，每次1.0 h，计算5 份提取物的综合评分。结果见图4 A，表明固定其他条件不变，加水量为8，10，12倍时提取物的综合评分较高。

提取时间：按处方比例称取等量水提药材饮片5份，每份各加相当于饮片10 倍量的水提取1 次，分别提取0.5，1.0，2.0，2.5 h，计算5 份提取物的综合评分。结果见图4 B，表明固定其他条件不变，提取时间为1.0，1.5，2.0 h时提取物的综合评分较高。

提取次数：按处方比例称取等量水提药材饮片4份，每份各加相当于饮片10 倍量的水，分别提取1，2，3，4 次，每次1.0 h，计算4 份提取物的综合评分。结果见图4 C，表明固定其他条件不变，提取物综合评分在提取次数为1，2，3次时呈明显增长趋势，但提取次数为3，4 次时基本持平，已接近提取完全，故选择提取次数为1，2，3次。

图4 水提工艺单因素多水平考察结果Fig.4 Results of single-factor and multi-level investigation of water extraction process

2.5.3 因素与水平

醇提/水提工艺因素与水平分别见表5和表6。

表5 醇提工艺因素与水平Tab.5 Factors and their levels of alcohol extraction process

表6 水提工艺因素与水平Tab.6 Factors and their levels of water extraction process

2.5.4 正交试验与方差分析结果

醇提工艺：采用L（934）正交表进行试验，结果见表7，方差分析结果见表8。由表7 极差分析结果可知，4 个因素对醇提工艺的影响大小依次为A>C>D>B，因素不同水平对醇提工艺结果的综合评分影响顺序为A2>A1>A3，B3> B2> B1，C2> C1> C3，D3> D2> D1，但影响因素 B的K1，K2，K3相差不大。通过综合评分可知，最佳醇提工艺为A2B1C2D3。由表8 方差分析结果可知，乙醇体积分数（A）和提取时间（C）对醇提工艺的影响均显著（P<0.05），而溶剂用量（B）和提取次数（D）对醇提工艺的影响的不显著（P>0.05）。为适应医院制剂的实际生产需要，最终确定最优醇提工艺为A2B1C2D3，即加8 倍量70%乙醇，提取3次，每次40 min。

表7 醇提工艺L9（34）正交试验结果Tab.7 Results of the L9（34） orthogonal test of alcohol extraction process

表8 醇提工艺综合评分方差分析结果Tab.8 Results of ANOVA of comprehensive score of alcohol extraction process

水提工艺：采用L9（34）正交表进行试验，结果见表9，方差分析结果见表10。由表9 极差分析结果可知，3 个因素对水提工艺的影响大小依次为C>A>B，因素不同水平对水提工艺结果的综合评分影响顺序为A3> A2>A1，B2>B1>B3，C3>C2>C1，但影响因素 B 的K1和K2相差不大。通过综合评分可知，最佳水提工艺为A3B1C3。由表10方差分析结果可知，提取次数（C）对水提工艺的影响显著（P<0.05），而加水量（A）和提取时间（B）对水提工艺的影响不显著（P>0.05）。为适应医院制剂的实际生产需要，最终确定最优水提工艺为A3B1C3，即加12倍量水，提取3次，每次1.0 h。

表9 水提工艺L9（34）正交试验结果Tab.9 Results of the L9（34） orthogonal test of water extraction process

表10 水提工艺综合评分方差分析结果Tab.10 Results of ANOVA of comprehensive score of water extraction process

2.6 验证试验

取10倍处方量的同一批药材3份，按2.5项下优选的醇提/水提工艺条件分别进行提取，醇提物/水提物按2.1项下色谱条件分别进样测定，并按正交试验中的综合评分法（各指标最大值按正交试验中的最大值计）对最终结果进行评分。结果见表11 和表12，表明该醇提/水提工艺有较好的稳定性及重复性，可用于坐浴安散的工业化生产。

表11 醇提工艺验证试验结果（n=3）Tab.11 Results of the verification test of alcohol extraction process（n=3）

表12 水提工艺验证试验结果（n=3）Tab.12 Results of the verification test of water extraction process（n=3）

根据此验证试验结果，最终拟订坐浴安散的提取工艺为按处方比例称取大黄，加入8 倍量的70%乙醇，提取3 次，每次40 min，合并乙醇液浓缩至少量；醇提后的药渣与按处方比例称取的另外4 味药材（功劳木、苦参、五倍子、两面针）一同进行水提，加入12 倍量的水，提取3 次，每次1.0 h，合并提取液，浓缩至少量。

3 讨论

3.1 HPLC 法含量测定中提取溶剂筛选

三氯甲烷为传统有机溶剂，毒性高，对人体伤害大，应慎用，而二氯甲烷的毒性较低，适合实验室提取（萃取）工艺操作［15］。故本研究中选用二氯甲烷替代三氯甲烷作为大黄和苦参制备供试品溶液的提取（萃取）溶剂，结果可行。

3.2 工艺优选指标及权重确定

中药复方制剂成分复杂，疗效是多种有效成分共同作用的结果。本研究中依据君臣佐使的配伍原则，参照坐浴安散药理作用的整体性，兼顾其多成分、多靶点作用的特点，根据各指标间的重要性差异，运用AHP 法确定各指标权重。AHP 法是一种定性和定量相结合的决策分析方法，通过数理运算将主观对各项指标的重视程度与各项指标间的相互联系转变为可量化的权重系数，对权重进行一致性检验，以判断矩阵的可接受性，实现定性到定量的转化，用于存在多种有效成分的中药复方制剂提取工艺研究的综合评价具有一定的科学性与合理性［16-17］。本研究中采用正交试验结合多指标综合评分法，以方中的君臣药大黄、功劳木、苦参中有效成分大黄酸、大黄素、大黄酚、盐酸小檗碱、苦参碱、氧化苦参碱的含量及干膏得率为考察指标，对坐浴安散的提取工艺进行了优化。优化的提取工艺稳定、可靠，有效成分提取完全，为该制剂的工业化生产提供了实验依据。

3.3 工艺优化结果比较

坐浴安散优化前的提取工艺为大黄、功劳木、苦参、五倍子、两面针5味药材加水煎煮2次，第1次2.0 h，第2次1.5 h，合并煎液。根据文献［18-19］报道及2020年版《中国药典（一部）》中所载复方制剂的制法工艺，大黄在复方制剂中的提取工艺多为醇提。故后续试验中取等量的同一批药材2份，采用旧工艺与本研究中优化工艺分别提取，测定并比较提取物，发现优化后的工艺中，君药大黄的各项指标提升明显，方法确切有效，具有可操作性，可用于坐浴安散的实际生产，进一步提升了该制剂的质量。