米渣蛋白水解物对酸奶促发酵及品质的影响

张 成，郭元博，薛 婧，王芝晓，龙 肇

中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004

0 引言

乳酸菌生物合成能力弱，利用蛋白质氮的能力低，在酸奶中人为添加碳源和氮源可以促进乳酸菌的生长。植物蛋白水解产物主要成分是小分子肽和游离氨基酸，是促进乳酸菌生长代谢良好的氮源[1，2]。添加蛋白水解物不仅有利于促进乳酸菌在发酵过程中的产酸能力，而且可赋予酸奶良好的品质特性。Wang等[3]证实，添加小分子蝉蛹肽对酸奶中乳酸菌的增殖有明显促进作用。廖兰等[4]发现，添加小麦蛋白肽在缩短酸奶发酵周期的同时，提高了酸奶的黏度和感官得分。董世荣等[5]研究表明，添加胶原蛋白肽提高了酸奶的硬度和持水能力。Varedesara等[6]证实，葡萄籽蛋白水解物有利于抑制酸奶贮藏期间的乳清析出。

但目前的研究大多是利用可溶性植物蛋白以及动物蛋白发酵酸奶，它们溶解性良好，易被乳酸菌吸收利用。但价格昂贵，若大量用于酸奶基质中，大大增加了生产成本。而且只局限于对酸奶发酵后的品质进行研究，缺少酸奶贮藏期间品质变化的研究。米渣蛋白作为生产淀粉糖浆、有机酸和味精的工业副产品，产量极大，但因其溶解性极差，很难应用到食品工业中，目前多用于动物饲料。本文利用碱性蛋白酶对米渣蛋白进行水解，通过添加1%，2%，3%，4%，5%的米渣蛋白水解物，探究促发酵效果最好的添加量。在最适添加量条件下，研究不同水解度下的米渣蛋白水解物对酸奶促发酵能力的影响，并通过质构特性、持水力、感官得分的方法研究酸奶在贮藏期间的品质变化。为米渣蛋白的充分利用以及降低酸奶企业的成本提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米渣蛋白（蛋白质含量为79.02%），无锡金农生物科技有限公司；全脂奶粉（蛋白质含量为24.50%、脂肪含量为26.30%），新西兰乳品有限公司；丹尼斯克300型酸奶发酵剂（嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种），丹尼斯克（中国）有限公司；葡萄糖，阜丰营销有限公司；蔗糖，河南万邦化工科技有限公司；碱性蛋白酶（400 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司；Gly-Gly-Gly（189 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 Da）、杆菌肽（1 423 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、细胞色素c（12 384 Da），美国Sigma公司。高效液相色谱所用试剂为色谱级，其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AuY220 电子分析天平，岛津（香港）有限公司；Five Easy pH计，梅特勒托利多（上海）有限公司；TDZ5-WS 低速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；D-6L 高压均质机，美国PhD公司；SPX-270生化培养箱，宁波东南仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；TA XT Plus 质构仪，英国 Stable Micro System 公司；Waters600 高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米渣蛋白水解物的制备

米渣蛋白按1∶10的料液比加水搅拌均匀，用1.0 M NaOH调pH至8.5，加入碱性蛋白酶4 000 U/g，于55 ℃恒温水浴分别搅拌水解6 h、12 h、18 h、24 h、36 h后，沸水浴10 min灭酶，冷却至25 ℃，用1.0 M NaOH调pH至7.0，3 000 r/min离心20 min，收集上清液冷冻贮藏。其中，水解6 h的水解物为A6，水解12 h的水解物为A12，A18、A24、A36以此类推。

1.3.2 水解物氨态氮的测定方法

参考张婧倩等[7]的方法，取4 g水解液，用去离子水补到80 g，0.1 M NaOH调pH至8.2，加10 mL甲醛，继续用0.1 M NaOH调pH至9.2，消耗NaOH体积为V1，以去离子水作空白，消耗NaOH体积为V2。氨态氮含量计算公式如下。

式中：C，NaOH标准溶液的浓度，mol/L；M，水解液的质量，g；0.014，氮的毫摩尔质量，g/mmol。

1.3.3 水解物蛋白含量的测定

参考Raya[8]的方法，取10.0 g上清液，加入10.0 mL浓硫酸，0.4 g硫酸铜，6.0 g硫酸钾，经石墨消解仪消化完成后，采用自动凯氏定氮仪进行测定。蛋白质含量计算公式如下。

式中：W，蛋白质的质量分数，%；M，样品质量，g；0.014，氮的毫摩尔质量，g/mmol；5.95，米渣蛋白质系数。

1.3.4 水解物水解度的计算公式

式中：DH为米渣蛋白水解物的水解度，%。

1.3.5 水解物分子量的测定

参考Zheng等[9]的方法，采用G2000 SWXL TSK凝胶色谱柱（7.8 mm ×300 mm，5 μm），0.5 mg/mL样品经0.22μm滤膜过滤后上机测试。色谱条件：流动相为乙腈：水：三氟乙酸=20∶80∶0.1，流速1 mL/min，进样量20 μL，检测波长214 nm，温度25 ℃。拟合标准曲线，y = -1.4507x + 11.5779，R2= 0.9958；y为各标准品相对分子质量的对数值，x为各标准品的出峰时间。

1.3.6 酸奶的制备

12.00 g全脂奶粉，4.25 g葡萄糖，4.25 g蔗糖混合均匀后，添加1%、2%、3%、4%、5% A24，以及添加不同水解度下的3%米渣蛋白水解物，用去离子水补至100 g，60 ℃恒温下缓慢搅拌30 min至水化完成，冷却至常温后于20 MPa均质1次，85 ℃水浴灭菌10 min，冷却至42 ℃后接种20 DCU/100 L发酵剂，于42 ℃发酵至pH 4.40，快速冷却至18 ℃，4 ℃冷藏待用。

1.3.7 酸奶 pH值的测定

在酸奶发酵过程中每隔1 h用pH计对酸奶的pH值进行测定，每次使用前后都用pH为4.01，7.00的磷酸缓冲溶液校准。

1.3.8 酸奶可滴定酸度的测定

在酸奶发酵过程中每隔1 h对酸奶的可滴定酸度进行测定。

可滴定酸度的测定参考曾羲[10]的方法，称取5.0 g混合均匀的试样，置于150.0 mL锥形瓶中，加入25.0 mL新煮沸冷却至25 ℃的去离子水，搅拌均匀，加入0.2 mL酚酞指示剂，用标定后的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定至浅红色且10 s内不变色，用等体积的去离子水作空白对照，整个滴定过程在60 s内完成。可滴定酸度计算公式如下。

式中：X，试样的酸度，°T；C，NaOH标准溶液的浓度，mol/L；V1，滴定试样消耗NaOH溶液的体积，L；V0，空白滴定消耗NaOH溶液的体积，L；100，100 g试样；M，试样的质量，g；0.1，酸度理论定义NaOH的摩尔浓度，mol/L。

1.3.9 酸奶质构特性的测定

分别在4 ℃冷藏1 d，7 d，14 d，21 d的酸奶取出立即进行质构测定。每个样品做3 次平行。测试参数及设置值见表1。

表1 质构仪测试参数及设置值

1.3.10 酸奶持水力的测定

取在4 ℃下冷藏1 d，7 d，14 d，21 d的酸奶样品10 g，参考Xz等[11]的方法，在25 ℃条件下，3 000 r/min离心20 min，倒出上清物，保持离心管倒置10 min，结束后立即称重。每个样品做3次平行。持水力计算公式如下。

式中：WHC，酸奶持水力，g/g；M1，酸奶离心后沉淀和离心管总重，g；M0，离心管质量，g；M2，酸奶质量，g。

1.3.11 酸奶感官品质的测定

在4 ℃冷藏1 d取出酸奶，测定酸奶的感官特性。感官评定由经培训的50名专业品评人员鉴评（男25名、女25名），对试样的色泽、气味、滋味和组织状态进行评分。酸奶感官评价标准见表2。

表2 酸奶感官评价标准

1.3.12 数据处理与分析

所有试验均重复3 次，用Origin 2018进行数据处理，SPSS 22.0进行多重比较分析（P＜0.05）。数据表示为“平均值±标准偏差”。

2 结果与讨论

2.1 米渣蛋白水解物的水解度和蛋白质含量

表3显示了不同水解时间的米渣蛋白水解物的水解度和蛋白质含量，结果表明在水解时间6~36 h内，随着水解时间的延长，米渣蛋白的蛋白质含量呈增加趋势，氨态氮含量逐渐增加，水解度逐渐增大。其中A18蛋白质含量较A6提高了9.25%，A24氨态氮含量较A6增加了22.22%，A36水解度较A6上升了30.45%。这是因为水解时间的延长，使得碱性蛋白酶与米渣蛋白充分接触，米渣蛋白更多的肽键被打开，生成了小分子肽和游离氨基酸[12]。

表3 米渣蛋白水解物的水解度和蛋白质含量

2.2 米渣蛋白水解物分子量组成

米渣蛋白水解物的分子量分布见表4，由表4可知，米渣蛋白在水解时间（6~36 h）下，增加水解时间，水解物中大于1 000 Da含量不断减少，小于1 000 Da含量逐渐增加。其中，A6小于1 000 Da的含量为74.54%，A36小于1 000 Da的含量则提高至83.07%。水解物中小分子含量的上升说明碱性蛋白酶可以较好的把米渣蛋白水解为小分子肽和游离氨基酸。

表4 米渣蛋白水解物的分子量分布（%）

2.3 A24不同添加量对酸奶发酵时间的影响

图1显示了碱性蛋白酶水解24 h得到的米渣蛋白水解物不同添加量下对酸奶发酵时间的影响。由图可知，在水解物添加量1%~3%条件下，随着添加量的增加，酸奶的发酵时间逐渐缩短；其中CK发酵时间为7.21 h，添加1%的A24可以缩短发酵时间0.71 h，当添加量增加至3%，酸奶发酵时间则可以缩短1.09 h。而当A24添加量增加至4%时，酸奶的发酵时间较空白有所延长，说明过高的添加量则会抑制酸奶的发酵；可能是因为米渣蛋白水解物添加量过高影响了酸奶基质中的pH值和渗透压，反而不利于乳酸菌的生长。由图可得米渣蛋白水解物在3%添加量条件下，对酸奶的促发酵能力最好。

图1 A24不同添加量对酸奶发酵时间的影响

2.4 添加3%米渣蛋白水解物对酸奶促发酵的影响及比较

图2显示了米渣蛋白水解物不同水解度下酸奶发酵期间的pH变化，由图看出所有酸奶的pH下降速度都呈现先增大后减小的趋势。与对照组相比，添加3%（w/w）米渣蛋白的酸奶不但没有促进发酵效果，反而延长了发酵时间，可能是由于米渣蛋白溶解性差，很难被分解成可溶性氮，而乳酸菌利用蛋白质氮的能力低，因此不利于发酵期间乳酸菌的增殖产酸[13]。随着水解度的增加，酸奶发酵时间持续缩短，其中A6较CK缩短了0.21 h，当水解时间延长至36 h，发酵时间较CK缩短了1.58 h。这与谭允冰等[14]研究大豆蛋白酶解产物对酸奶的促发酵结果类似。米渣蛋白在水解过程中被分解成分子肽和游离氨基酸，这为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长提供了可溶性氮源。

图2 米渣蛋白水解物对酸奶发酵时间的影响

图3显示了酸奶可滴定酸度随发酵时间的变化，由图可知在发酵前2 h，所有酸奶的酸度增加趋势相当，添加米渣蛋白水解物没有改变乳酸菌的迟滞时间。发酵2 h后，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进入对数增长期，导致酸奶可滴定酸度急剧增大。添加米渣蛋白水解物的酸奶滴定酸度在2 h后显著高于未添加样。与酸奶发酵期间pH下降趋势相同，水解时间越长，可滴定酸度增加速率越高。小分子肽和游离氨基酸促进了乳酸菌在发酵期间的生长代谢，提高了乳酸菌的产酸能力[15]。发酵后期所有酸奶的酸度增加趋于平缓，可能是因为乳酸含量的提高抑制了菌种继续产酸的能力[16]。

图3 米渣蛋白水解对酸奶滴定酸度的影响

2.5 米渣蛋白水解物对酸奶质构特性的影响

质构仪分析是一门重要的食品分析技术，通过模拟人体口腔的咬和咀嚼来评价酸奶的质构特性[17]。硬度是指酸奶达到一定形变需要的力，反映了酸奶凝胶网络结构的强度。黏度是探头为了测试酸奶的黏附性而做的功，它对酸奶的口感有积极影响，且是控制酸奶稳定性的重要因素[18]。内聚性表示酸奶内部结合的强度；弹性是指酸奶经过第一次压缩后再恢复的能力，取决于很多因素，如热处理、蛋白质相互作用等[19]。咀嚼性是指酸奶在咀嚼过程中需要的能量。

表5显示了不同酸奶贮藏期间的质构特性。由表可知，随着贮藏时间的延长，所有酸奶的硬度、黏度都逐渐减小。贮藏第1 d，CK硬度为25.05 g，而A24的硬度为29.96 g；A36的硬度为25.06 g。这可能是因为适度水解使得米渣蛋白被分解成的小分子肽和游离氨基酸有利于加强酸奶贮藏期间的蛋白质胶束作用[20]，过度水解则会破坏米渣蛋白的小分子活性肽[21]。酸奶的黏度与酸奶固形物的含量，均质条件，发酵温度等因素有关[22]。贮藏第21 d，CK的黏度为-21.00 g，而A24的黏度为-30.30 g。可能米渣蛋白小分子活性肽更好的被嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌吸收，酸奶胞外多糖的含量逐渐升高，从而提高了酸奶多糖-多糖，蛋白-多糖的相互作用[23]。由表可知，酸奶的内聚性没有显著性差异，A24的弹性、咀嚼性明显高于CK，说明A24具有更好的凝胶网络结构。

表5 米渣蛋白水解物对酸奶贮藏期间质构特性的影响

2.6 米渣蛋白水解物对酸奶持水力的影响

持水力可以反映酸奶凝胶网络结构保持水分的能力，如果酸奶的持水力不强，会导致乳清析出严重，影响酸奶的口感和外观，货架期也会缩短。

添加不同水解度水解物的酸奶在贮藏期间持水力的变化如图4，由图可知，随着贮藏时间的延长，酸奶的持水力不断减小。这是因为贮藏时间的增加导致乳酸菌分泌更多的蛋白水解酶，使得酸奶体系中微小的蛋白质亚胶体结构发生改变，从而减弱其亲和连接作用，造成胶体网络结构结合水含量下降[24]。添加不同水解程度的米渣蛋白水解物时酸奶持水力基本呈先增大后减小趋势。由图可知，在贮藏1 d时，CK的持水力为0.54%，而A24的持水力为0.66%，说明添加米渣蛋白水解物显著提高了酸奶的持水能力。这与刘晓恒[25]发现酸奶中添加大豆蛋白导致酸奶凝胶结构更加紧密，蛋白质胶束连接作用增强，酸奶持水力增加类似。

图4 米渣蛋白水解物对酸奶贮藏期间持水力的影响

2.7 米渣蛋白水解物对酸奶感官品质的影响

感官评价是指通过人的味觉、触觉、视觉等感官对食品评价的一门科学[26]。酸奶的感官评价主要包括色泽、气味、滋味、组织状态四个方面，每一方面的得分都会影响最后的结果。不同酸奶的感官得分如表6。可以看出，添加米渣蛋白水解物的酸奶色泽得分低于空白组，并且其水解时间越长，酸奶的色泽得分越低。由表看出，添加米渣蛋白水解物对酸奶组织状态的影响最为显著。酸奶的组织状态与酸奶的硬度、黏度和持水能力密切相关，其持水能力越高的酸奶凝胶网络结构越紧密，从外观表现为组织状态好，没有乳清析出[27]。从感官总分可以看出，A24得分为9.33，明显高于CK的8.78；说明添加米渣蛋白水解物赋予酸奶一定的大米香味，提高了酸奶的感官特性。

表6 米渣蛋白水解物对酸奶感官品质的影响

3 结论与展望

相比米渣蛋白水解物1%，2%，4%，5%添加量，3%米渣蛋白水解物明显缩短了酸奶的发酵时间，在一定水解时间（6~36 h），水解时间越长，米渣蛋白水解物对酸奶促发酵效果越显著。在贮藏期间（1~21 d），酸奶的硬度、黏度都呈现下降趋势。酸奶在贮藏1 d后，A24的硬度较CK提高了19.60%，黏度较CK增加了23.73%；说明适宜水解度下的米渣蛋白水解物显著改善了酸奶贮藏期的质构特性。在相同贮藏时间下，A24的持水力明显高于CK，说明添

加米渣蛋白水解物赋予酸奶较好的凝胶网络结构，使其结合水能力变强。米渣蛋白水解物虽然降低了酸奶的色泽，但提高了酸奶的组织状态，改善了酸奶的感官特性。

总体而言，米渣蛋白水解物富含丰富的多肽和氨基酸等成分，通过控制水解时间调整米渣蛋白水解物合适的水解度，将其添加到酸奶基质中，既可以缩短酸奶的发酵时间，同时有利于酸奶的品质。为米渣蛋白在食品工业中的应用扩大了价值。

本文研究局限于米渣蛋白水解物对酸奶发酵和品质的影响，关于对嗜热链球菌和乳酸杆菌的生长代谢机制没有深入的研究，也没有继续探讨米渣蛋白水解产物对微生物的基因调控和表达。这也是今后需要研究的方向之一。