雷帕霉素通过调控NLRP3炎症小体抑制成纤维样滑膜细胞增殖*

杨俊杰，景铭，刘佳宇，孙萌萌，史雅彤，赵煜炜，辛文妤

(滨州医学院药学院，烟台 264003)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，主要表现为全身性关节肿痛、滑膜组织异常增生等，其发病机制至今未明[1]。研究表明，成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA的发生发展中起至关重要的作用，FLS异常增殖和侵袭，最终导致关节和软骨的破坏[2]。而核苷酸寡聚化结构域样受体(nod-like receptor，NLR)家族PYRIN域蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体在RA患者滑膜增殖过程中被激活且在滑膜组织中过表达[3]。NLRP3炎症小体是由传感-NLRP3、衔接子-凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC)、效应蛋白-前半胱天冬蛋白酶(pro-caspase-1)三者相互结合形成的多蛋白复合物，发挥激活机体免疫炎症的关键作用[4-5]。NLRP3炎症小体的激活至少需要两个信号：一是上调NLRP3和pro-IL-1β的启动信号[6]；二是由对病原相关分子模式和危险相关分子模式刺激ASC和pro-caspase1的装配，最终使NLRP3炎性小体激活[7]。近几年研究发现，RA中NLRP3炎性小体异常激活，其活化的下游产物半胱天冬蛋白酶(caspase-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)在RA炎症活动过程中扮演了重要的角色[8-9]。

自噬是一种重要的细胞内机制，它通过降解细胞内病原体、受损的细胞器等起到细胞保护作用。研究表明自噬与RA-FLS的凋亡抗性，破骨细胞形成以及最终严重的骨和软骨破坏有关[10-11]。研究发现细胞自噬与NLRP3炎症小体之间相互调控关系紧密，可通过抑制NLRP3炎性小体激活使RA炎症症状减轻[12]。雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是一种大环内酯类免疫抑制剂，可以抑制mTOR信号通路的mTORC1，从而激活自噬。但RAPA对于FLS细胞的作用笔者未见报道。本实验研究自噬促进剂RAPA对FLS细胞增殖以及NLRP3炎症小体激活的影响，探讨其潜在的机制，旨在为开发自噬相关药物治疗RA提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料 FLS细胞由烟台大学药学院提供，为人源滑膜组织提取，已进行过特征性的鉴定[13]。本实验按照“滨州医学院医学伦理委员会—涉及人的生物医学研究项目伦理审批件”执行，批准号：2018-20。RAPA(分子式：C51H79NO1；相对分子质量：914.19；纯度≥98%；批号：53123-88-9)购自上海麦克林生化科技股份有限公司。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)购自Sigma-Aldrich公司。CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒(中国biosharp，批号：BS350B)。高内涵成像系统(OperettaTM，美国PerkinElmer公司)。透射电子显微镜(型号：JEM-1400，日本电子株式会社)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 FLS细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶放入37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中消化2 min。加入血清终止消化后，在含10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液中培养。FLS细胞传代至4～6代，用于后续实验。

1.2.2CCK-8法检测细胞活力及RAPA对FLS增殖的影响 将传代的FLS细胞接种于96 孔板中，每孔细胞悬液100 μL(每孔含细胞5×103个)。根据实验需要设置对照组及不同药物浓度RAPA(100，200和400 nmol·L-1)组，每组设复孔3个。在接种细胞24 h后进行给药处理，分别在含有相应浓度RAPA的DMEM/F12培养液中培养48 h，采用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力，选择适宜的浓度进行后续实验。之后将细胞分为对照组、TNF-α组、RAPA(100，200 nmol·L-1)组，RAPA预处理2 h，加入TNF-α(10 ng·mL-1)孵育48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃继续孵育2 h，测定450 nm处吸光度值(A值)，计算细胞活力。细胞活力(%)=(测定组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.2.3透射电子显微镜观察RAPA对FLS细胞自噬小体的影响 取对数生长期细胞接种于96孔板中，将细胞分为：对照组、TNF-α组、RAPA组。RAPA组加入200 nmol·L-1RAPA培养2 h，每孔加入10 ng·mL-1TNF-α10 μL，对照组给予相应体积培养液，TNF-α刺激48 h后收集细胞于1.5 mL EP管中，400×g离心10 min，弃去上清液，4 ℃戊二醛中过夜；PBS清洗3次，每次10 min，后经4 ℃的1%锇酸固定1.5 h，常规乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂浸透、包埋、聚合；制备厚度0.5 μm半薄切片光镜定位后，再制备60 nm厚度超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，透射电子显微镜观察。

1.2.4免疫荧光法检测RAPA对FLS细胞LC3B表达的影响 按照文献[14]的方法，采用细胞免疫荧光观察FLS细胞内的自噬水平。按照“1.2.3 ”的方法对细胞进行预处理，之后采用4%多聚甲醛溶液室温固定30 min；PBS洗涤3次，每孔加入0.3% Triton-X100溶液50 μL，室温静置15 min；PBS洗涤3次，每孔加入LC3B一抗(用1%无菌BSA以1：200稀释为工作液)50 μL，4 ℃静置过夜。次日37 ℃下避光孵育二抗(羊抗兔IgG-TRITC，1：1000)2 h，随后用DAPI染核30 min，以PBS轻轻洗细胞3次，使用高内涵成像系统对细胞进行成像与分析。

1.2.5蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测自噬与NLRP3炎症小体相关蛋白 按照“1.2.3”的方法对细胞进行预处理，离心收集细胞，低温条件下裂解细胞，高速离心后吸取上清液，BCA 法测定蛋白浓度，按比例加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min，-20 ℃保存。每组取蛋白质样本30 μg进行凝胶电泳，然后转膜、封闭。经SDS-PAGE电泳与湿转法转膜，封闭后经一抗、二抗孵育，化学发光显影后采用图像处理软件进行分析。

2 结果

2.1RAPA对FLS细胞增殖的影响 CCK-8检测结果表明，400 nmol·L-1RAPA能明显抑制FLS的细胞活力(P<0.05)，而100，200 nmol·L-1RAPA对FLS细胞活力无明显影响，说明RAPA在低于200 nmol·L-1时对FLS细胞无明显毒性作用(图1)。因此，后续实验中采用≤200 nmol·L-1RAPA作为给药组剂量。

以对照组细胞增殖活力为100%计算，TNF-α组细胞增殖活力为(120.56±1.25)%，表明TNF-α可明显诱导FLS增殖；与TNF-α组比较，100，200 nmol·L-1RAPA组细胞活力明显下降(P<0.05)，说明RAPA可明显抑制FLS细胞的增殖(图1)。

A.对照组；B.TNF-α组；C.100 mol·L-1RAPA组；D.200 mol·L-1RAPA组；①与空白对照组比较，t=4.538，27.89，P<0.05；②与TNF-α组比较，t=3.793，11.58，P<0.05。

2.2RAPA对FLS细胞内自噬小体的影响 透射电镜下观察可见，FLS细胞凸起且长，细胞核较为规整，核内染色质疏松，呈细颗粒状分布在细胞核周围。核仁明显，粗面内质网丰富，细胞质突起长而粗，细胞质中往往缺乏高尔基复合体，可见少量小泡和囊泡[15]。TNF-α组细胞内自噬小体增多，细胞核呈不规则；RAPA组FLS细胞细胞质中自噬小体和自噬溶酶体明显多于TNF-α组，且透射电镜下可见典型细胞凋亡：细胞浆致密，细胞器互相靠近，染色质浓缩，沿核膜排列，形成不同形状及大小块状，线粒体肿胀及空泡样变，可见核碎裂及凋亡小体(图 2)。

A.对照组；B.TNF-α组；C.200 mol·L-1RAPA组；①与对照组比较，t=4.950，P<0.01；②与TNF-α组比较，t=3.474，P<0.05。

2.3RAPA对FLS细胞内LC3B蛋白水平的影响 采用绿色荧光标记自噬蛋白LC3B，绿色斑点代表自噬体的形成[16]。免疫荧光结果显示，TNF-α组绿色荧光呈弥散状分布于细胞中，LC3B蛋白表达较多且表达于细胞质中，荧光较为强烈。RAPA组绿色荧光成斑点状出现在细胞中，荧光增强。结果表明：与对照组比较，10 ng·mL-1的TNF-α增加FLS细胞内LC3B蛋白的表达，而RAPA能够进一步增强LC3B蛋白的表达，细胞自噬水平升高，见图3。

A.对照组；B.TNF-α组；C.200 mol·L-1RAPA组；①与对照组比较，t=3.641，P<0.01；②与TNF-α组比较，t=5.398，P<0.01。

2.4RAPA对FLS细胞自噬及NLRP3信号通路的影响 进一步探索在FLS细胞增殖过程中RAPA与NLRP3炎症小体激活之间的关系。采用TNF-α诱导FLS细胞增殖，结果显示TNF-α预处理后自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1水平增加，同时NLRP3炎症小体的表达水平也相应提高。采用RAPA处理后，FLS细胞内LC3-II、Beclin1的表达水平进一步增加，P62的表达水平下调，说明RAPA诱导FLS细胞自噬水平提高；同时，采用RAPA处理后细胞内NLRP3、caspase-1的表达水平下调，说明NLRP3炎症小体的活化被抑制(图 4)。结果表明RAPA可以进一步诱导FLS细胞自噬，同时相应地抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。

A.对照组；B.TNF-α组；C.200 mol·L-1RAPA组；①与对照组比较，t=2.221～6.791，P<0.01；②与TNF-α组比较，t=2.834～9.889，P<0.01。

3 讨论

RA是一种慢性、全身性自身免疫性疾病，其特征是关节滑膜持续发炎[17]。滑膜内层组织中出现的炎症细胞的浸润以及RA患者FLS细胞的增殖和凋亡平衡失调，使FLS不断地“肿瘤样”增生，是造成滑膜组织增生和关节结构破坏的主要原因[18]。TNF-α是一种主要的免疫调节和前炎性因子，其在RA中表达上调且在RA病理机制中发挥重要作用。TNF-α在RA中刺激滑膜细胞和软骨细胞合成PGE2和胶原酶，引起骨和软骨的吸收破坏，促进成纤维细胞的增生[19]。并且TNF-α可刺激体外培养的滑膜细胞NF-κB活化以及IL-6、IL-1β等炎症因子分泌[20]。故本研究采用TNF-α处理FLS细胞，经TNF-α诱导后，FLS细胞增殖活力明显升高，同时NLRP3炎症小体表达升高。这与WANG等[21]造模方式一致，较好模拟RA患者体内病理学特点。

自噬是真核细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程[22]。研究表明，NLRP3炎症小体的活性受到自噬的负调控，自噬可以通过不同的机制调节NLRP3炎症小体的激活[23-24]。自噬可以通过降解炎症小体进而负调控炎症小体活性、降低炎性因子IL-1β、IL-18水平从而在骨关节炎中发挥重要作用[25]。研究发现RAPA可通过抑制NF-κB/MAPK信号通路产生抵抗炎症的作用[26]。同时RAPA还能抑制Th17细胞增殖并诱导Treg细胞的分化，从而降低炎症因子水平，改善RA[27]。基于此，采用自噬诱导剂RAPA探讨其在FLS细胞增殖过程中对NLRP3炎症小体激活的影响。

研究发现，RAPA可下调NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体的活化，减少炎症因子TNF-α、IL-1β的表达[28]；此外，RAPA通过以自噬和P62/SQSTM1依赖方式限制NLRP3炎症小体的活化[29]。研究表明，RAPA对NLRP3炎症小体活化通路的两种信号均可产生影响，即有效抑制NLRP3和caspase-1表达升高，这可能是基于对mTOR/TLR4信号通路的抑制[30]，也有可能是直接通过对NLRP3的抑制降低下游因子的持续上调[31]。本实验给予RAPA干预，200 nmol·L-1RAPA无明显细胞毒性且可以显著抑制FLS细胞的增殖。笔者采用透射电子显微镜和免疫荧光两种方法观察RAPA对FLS细胞中自噬的影响，发现TNF-α能够提高FLS细胞内自噬水平并引起细胞增殖，这可能与TNF-α刺激细胞产生炎症反应有关[32]，而RAPA可以进一步提高细胞内自噬水平但明显抑制细胞增殖。笔者对FLS细胞的自噬通路的分子机制进行探究，发现RAPA干预后LC3Ⅱ、Beclin-1表达水平均上调，P62表达水平下降，与此同时相应的NLRP3和caspase-1的表达水平下降。表明自噬促进剂RAPA对NLRP3炎症小体起到负向调控作用。结合研究结果，推测RAPA可以提高FLS细胞自噬水平从而清除堆积的有害物质，降低NLRP3炎症小体的表达，从而抑制炎性因子的释放进而在RA中起到防治作用。

综上所述，本研究结果显示RAPA可能通过增强FLS细胞中自噬水平，抑制NLRP3炎症小体的激活从而抑制了FLS细胞增殖。由此可推测在FLS细胞中自噬水平提高可以抑制NLRP3炎症小体的激活，这将为治疗RA提供一个新的方向，为进一步开发自噬调控剂及NLRP3炎性小体抑制剂用于治疗和预防RA及不同的自身免疫性疾病提供了实验基础。