芦丁通过抑制JAK2-STAT3信号通路活性改善MRL/lpr狼疮小鼠的肾损伤*

李海东，王旭，王艺睿，冯桂泽，倪佳慧，游艳，沈晓燕

(复旦大学药学院药理学系，上海 200120)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以自身产生大量抗体、损害自身组织、累及多系统多脏器、反复发作等为特征的自身免疫疾病[1]。SLE的病因较为复杂，异质性较强，与多种遗传与环境因素密切相关[2]。SLE的临床表现多样，主要特征为因自身抗体的产生和免疫复合物的沉积而引起多器官的炎症和组织损伤[3]。其中，肾脏炎症及肾损伤是最常见且最严重的SLE并发症之一，通常表现为大量炎症细胞浸润，内皮增生，肾血管坏死，微血栓形成，肾小球重吸收与滤过功能急剧下降，肾功能残缺不全，是SLE患者预后不良及死亡的主要原因[4]。在全球范围内，SLE发病率逐年上升[5]。

目前对于SLE，临床治疗药物主要有糖皮质激素、抗炎药、免疫抑制剂及生物大分子制剂[6]。然而使用这些药物的副作用仍是困扰人们多年的难题。芦丁(rutin)，又名芸香苷、维生素P，广泛存在于芸香、枣、杏、橙皮、番茄、荞麦等植物中，属于天然黄酮苷[7]。芦丁具有广泛的药理作用，主要包括抗自由基、抗脂质过氧化、拮抗血小板活化因子、维持血管张力以及抗炎等作用。同时，芦丁在抗衰老、抗过敏、抗病毒等方面也具有显著功效[8]。然而，芦丁对于SLE的作用研究甚少，笔者在本实验探究芦丁对MRL/lpr自发性红斑狼疮小鼠的作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 雌性Balb/c小鼠和雌性MRL/lpr小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2022-0004，分笼饲养于复旦大学药学院无特定病原体(SPF)级动物房。饲养温度 20～24 ℃，相对湿度(50±5)%。饲料与水均经过消毒，并由动物自由摄取。小鼠实验前适应性饲养 7 d。

1.1.2药品与试剂 芦丁(大连美仑生物技术有限公司，批号：MB5118，含量：>97%)。醋酸泼尼松片(prednisone acetate，PA，浙江仙琚制药股份有限公司，批号：190337)。肌酐(CRE)测定试剂盒(货号：C011-2-1，批号：20200603)、尿素氮(BUN)测试盒(货号：C013-2-1，批号：20200603)和尿蛋白定量测试盒(CBB法)(货号：C035-2-1，批号：20200527)均购于南京建成生物工程研究所。小鼠抗dsDNA lgM(5130，批号：200618K7)和小鼠抗dsDNA lgG(5120，批号：200618K6)均购于美国Alpha diagnostic。小鼠白细胞介素(IL)-6 酶联免疫吸附测定(ELISA)(1210602，批号：2005-1)和小鼠干扰素(IFN)-γ ELISA(1210002，批号：2001-1)均购于达科为生物技术有限公司。anti-JAK2 antibody (3230S，批号：201711)，anti-p-JAK2 antibody (3776，批号：201403) 均购于美国Cell Signaling Technology anti-p-STAT3 antibody (610189，批号：2326685) 购于美国Becton Dickinson。anti-GAPDH(AF0006)购于碧云天生物技术有限公司。

1.1.3仪器与设备 赛多利斯电子天平[型号：Secura324-1C，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，感量：0.1 mg]；电子天平(型号：JY50002，上海良平仪器仪表有限公司，感量：0.01 g)；摇床(型号：KB-800，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；电冰箱(型号：218STPS，青岛海尔股份有限公司)；磁力搅拌器(型号：GL-5250B，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；漩涡混合器(型号：VROTEX-1，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(型号：DHG-9030A，上海精宏试验设备有限公司)；电热恒温水槽(型号：DKB-8A，上海精宏试验设备有限公司)；多功能酶标仪(型号：Infinite 200 Pro，Tecan)；台式高速冷冻离心机(型号：5425R，Eppendorf公司)；-80 ℃冰箱(型号：FDE50086FV-UTLS，Thermo公司)；正置荧光显微镜(型号：Axio Observer，Carl Zeiss 公司)；化学发光成像系统(型号：BOX F3，Syngene公司)。

1.2动物分组与给药 以雌性Balb/c小鼠为正常对照(10只)，雌性MRL/lpr小鼠给药前称定质量并测定尿蛋白含量，所有MRL/lpr小鼠初始体质量均在29.3～30.6 g，按体质量分为低质量鼠(≤29.9 g，共25只)与高质量鼠(>29.9 g，共25只)，低质量鼠与高质量鼠分别按蛋白尿水平随机平均分为5组(每组5只)，1组低质量鼠与1组高质量鼠最终合并为1组(每组10只)，分别为模型对照组、醋酸泼尼松组及芦丁小剂量组、中剂量组和大剂量组。醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松0.1 mg·kg-1，芦丁小、中和大剂量组分别给予芦丁25，50，100 mg·kg-1；所有药物称取所需质量后，用对应体积0.9%氯化钠溶液溶解混匀。小鼠8周龄时开始按10 mL·kg·d-1灌胃给药，连续给药8周，正常对照组和模型对照组给予相同体积0.9%氯化钠溶液。

1.3尿蛋白浓度的测定 采用提尾反射法收集小鼠尿液，采用尿蛋白检测试剂盒(CBB法)检测小鼠尿蛋白浓度。用双蒸水调零，以563 mg·L-1蛋白标准液为标准，吸取尿液样品5 μL与CCB(考马斯亮蓝)试剂300 μL，充分混匀后，室温反应5 min，使用多功能酶标仪在波长595 nm处测定吸光度(A)值。

1.4血肌酐(CRE)与血尿素氮(BUN)的检测 实验结束时，采用CRE 测定试剂盒检测小鼠血清CRE含量，BUN测试盒检测小鼠BUN含量，按照试剂盒说明书操作。

1.5肾脏病理学检测 取小鼠右侧肾脏，于4%多聚甲醛中固定，经脱水，石蜡包埋，制备石蜡切片进行苏木精-伊红(HE)染色。在显微镜下观察切片，并进行病理评分，对肾小球、肾间质以及血管的病理损伤进行分级评分[9]。

1.6血清中自身抗体与细胞因子检测 采用ELISA法检测血清中Anti-dsDNA IgG、Anti-dsDNA IgM、IFN-γ、IL-6的含量，按照试剂盒说明书操作。

1.7免疫印迹分析蛋白含量 通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离小鼠肾脏组织裂解物的等量总蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上，根据已建立的方法进行免疫印迹分析[10]。

2 结果

2.1尿蛋白含量 每2周进行小鼠尿蛋白水平检测显示，最初每组小鼠尿蛋白含量差异无统计学意义，随着实验的进行，从第4周开始，模型对照组小鼠尿蛋白水平逐渐升高，并明显高于正常对照组，说明由于自身抗体的沉积，MRL/lpr小鼠出现严重的自发性肾损伤。而在第4与第6周，与模型对照组比较，各剂量给药组小鼠尿蛋白浓度有下降的趋势，但差异无统计学意义。给药8周后，与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和芦丁大剂量组小鼠平均尿蛋白含量显著降低(P<0.05或P<0.01)，结果见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.醋酸泼尼松组；D.芦丁小剂量组；E.芦丁中剂量组；F.芦丁大剂量组。①与正常对照组比较，t=2.641，P<0.05；②与正常对照组比较，t=4.115，6.312，P<0.01；③与模型对照组比较，t=3.022，P<0.05；④与模型对照组比较，t=4.804，P<0.01。

2.2小鼠血清中Anti-dsDNA IgG和IgM含量 醋酸泼尼松组和芦丁中、大剂量组小鼠血清中Anti-dsDNA IgG含量显著低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)，并且与剂量呈正相关。说明芦丁可以抑制Anti-dsDNA IgG在血液的累积。醋酸泼尼松组和芦丁中、大剂量组小鼠血清中Anti-dsDNA IgM含量均显著低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)。此外，芦丁大剂量组小鼠血清中Anti-dsDNA IgM的含量显著低于芦丁小剂量组(P<0.05)，体现出一定的剂量依赖性，结果见图2。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.醋酸泼尼松组；D.芦丁小剂量组；E.芦丁中剂量组；F.芦丁大剂量组。①与正常对照组比较，t=7.856，9.233，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.506，2.998，P<0.05；③与模型对照组比较，t=3.895～5.515，P<0.01；④与芦丁小剂量组比较，t=2.723，P<0.05。

2.3肾功能的影响 醋酸泼尼松组和芦丁小、中、大剂量组小鼠血清中CRE含量显著低于模型对照组(均P<0.01)。醋酸泼尼松组和芦丁中、大剂量组小鼠BUN含量显著低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)，且芦丁大剂量组小鼠血清中BUN含量显著低于芦丁小剂量组(P<0.05)，说明芦丁可剂量依赖性地抑制MRL/lpr小鼠的自发性肾损伤，结果见图3。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.醋酸泼尼松组；D.芦丁小剂量组；E.芦丁中剂量组；F.芦丁大剂量组。①与正常对照组比较，t=5.093，6.626，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.748，P<0.05；③与模型对照组比较，t=2.631～5.390，P<0.01；④与芦丁小剂量组比较，t=2.575，P<0.05。

2.4小鼠血清IL-6和IFN-γ含量 醋酸泼尼松组和芦丁中、大剂量组小鼠血清中IL-6含量均显著低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)，芦丁在25～100 mg·kg-1剂量范围内呈明显的剂量关系(P<0.05)。另外，醋酸泼尼松组和芦丁大剂量组小鼠血清中IFN-γ的含量显著低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)，结果见图4。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.醋酸泼尼松组；D.芦丁小剂量组；E.芦丁中剂量组；F.芦丁大剂量组。①与正常对照组比较，t=6.520，6.994，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.508，2.878，P<0.05；③与模型对照组比较，t=5.157～5.221，P<0.01；④与芦丁小剂量组比较，t=2.488，P<0.01。

2.5小鼠肾脏病变的影响 模型对照组小鼠肾脏出现严重的肾小球、肾间质及血管病理损伤，肾小球硬化并形成新月体，大量细胞浸润在血管周及间质区域，肾小球出现肿胀与增生。醋酸泼尼松组和芦丁小、中、大剂量组小鼠的肾小球、肾间质及血管病理损伤有一定程度的减轻，小鼠肾脏病理评分显著低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)，并呈现剂量依赖性(P<0.05)。表明芦丁在25～100 mg·kg-1剂量范围能显著减轻MRL/lpr自发性肾脏病变，结果见图5。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.醋酸泼尼松组；D.芦丁小剂量组；E.芦丁中剂量组；F.芦丁大剂量组。①与正常对照组比较，t=18.62，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.990，P<0.05；③与模型对照组比较，t=5.820～6.212，P<0.01；④与芦丁小剂量组比较，t=2.788，P<0.05。

2.6对小鼠肾脏组织JAK2-STAT3 信号通路活化的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠肾脏组织p-JAK2、p-STAT3的水平显著上调。与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和芦丁小、中、大剂量组小鼠肾脏组织p-JAK2、p-STAT3的水平受到一定程度的抑制，结果见图6。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.醋酸泼尼松组；D.芦丁小剂量组；E.芦丁中剂量组；F.芦丁大剂量组。①与正常对照组比较，t=5.863，6.443，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.978，P<0.05；③与模型对照组比较，t=3.751～5.624，P<0.01；④与芦丁小剂量组比较，t=4.211，P<0.01；⑤与芦丁中剂量组比较，t=3.506，P<0.01。

3 讨论

SLE是一种多系统参与的自身免疫性疾病，临床表现多样，从轻微的皮肤黏膜损伤到严重的多器官及中枢神经系统受累[11]。SLE 病因尚不明确，遗传、免疫、内分泌及环境等多种因素在其发病进程中起重要作用[11]。MRL/lpr小鼠是常用的SLE模型小鼠，带有与凋亡相关的Fas基因，Fas基因发生插入突变，导致异常转录，出现淋巴细胞增生基因(lymphoproliferative，lpr)，并产生大量抗体，并沉积在肾小球微血管，导致多种炎症递质的合成，最终引起细胞浸润，从而产生蛋白尿和功能性肾损害，是导致MRL/lpr小鼠死亡的重要原因[12]。本实验中模型对照组小鼠尿蛋白显著升高，血清中CRE、BUN等指标显著上升，炎性细胞大量浸润，肾脏病理损伤严重，提示该模型成功发病、症状明显。

Fas蛋白属于肿瘤坏死因子受体家族，是介导凋亡的重要蛋白。MRL/lpr小鼠由于逆转座子可转录成分ETn插入Fas基因的第二内含子中，导致Fas基因转录异常，引起Fas蛋白发生功能性缺陷而阻断淋巴细胞凋亡[13]。免疫系统依赖凋亡机制清除对自身抗原有特异性并产生免疫反应的细胞(包括T、B细胞)，而MRL/lpr小鼠存在凋亡缺陷，导致外周活化的T、B细胞大量存在，并出现高γ球蛋白血症。Fas突变使这些淋巴细胞增生却难以凋亡，在体内过度蓄积，细胞的基因组DNA作为抗原在体内产生大量anti-ANA、anti-ssDNA、anti-dsDNA、anti-snRNP等抗体，并在肾脏中沉积，造成功能性肾损伤[14]。因此，本研究中模型对照组小鼠体内dsDNA抗体大量沉积。而芦丁各剂量组则剂量依赖性地明显改善。其原因可能与芦丁对异常活化的T、B细胞的保护作用有关，具体机制需进一步探讨。

MRL/lpr小鼠在红斑狼疮发病过程中，肾脏会因dsDNA抗体沉积而发生损伤，使肾小球滤过功能和重吸收能力下降，具体表现为小鼠尿蛋白水平会逐渐升高[15]。本实验给予不同剂量芦丁后，小鼠尿蛋白水平较模型对照组显著降低，说明芦丁能够一定程度保护肾的滤过和重吸收功能。

BUN和CRE分别是人体蛋白质和肌肉的代谢产物，其终排泄器官为肾脏。因此当肾功能受损后，BUN和CRE无法有效排出，BUN和CRE的浓度因潴留而升高。因此血清中BUN和CRE水平是临床上反映肾功能的主要指标[16]。本研究发现模型对照组小鼠血清BUN和CRE的浓度较高，而不同剂量芦丁组BUN和CRE的水平显著降低，表明Rutin具有保护肾功能的作用。

随着时间的推移，MRL/lpr小鼠后期肾脏会出现严重的肾小球、肾间质及血管病理损伤，肾小球硬化并内凹，出现严重的肿胀与增生，肾间质及血管出现大量细胞浸润。这些病理变化是由抗体沉积以及多种炎症细胞因子信号传导途径共同作用的结果[17]。研究表明，芦丁具有抗炎、抗氧化等药理活性，同时对肝、肾、神经等具有保护作用[18]。与正常小鼠相比，模型对照组小鼠肾脏病理评分显著升高，模型对照组小鼠的肾脏出现严重病变，而各剂量芦丁组肾脏病变明显缓解，病理损伤评分显著降低。其原因与炎症有关，但具体机制有待进一步研究。

SLE可以促进肾脏炎症的发展。抗原抗体结合形成免疫复合物，于各组织器官沉积，肾脏尤为严重。免疫复合物沉积肾小球后破坏免疫平衡，引发炎症反应，IL-6、IFN-γ等炎性因子大量表达。在炎症细胞浸润及其他介质参与下，极易发展为狼疮性肾炎[19]。本研究显示，模型对照组小鼠炎性因子表达水平显著升高，而不同剂量芦丁组IL-6、IFN-γ炎性因子表达量显著下调。JAK-STAT被认为是与炎症相关的主要信号通路之一，介导IL-6、IFN-γ等炎性因子的表达[20]。研究表明，芦丁可以靶向结合JAK2，抑制JAK2-STAT3信号通路的激活并阻断下游炎症级联反应[21]。本研究结果显示芦丁可以抑制小鼠肾组织中JAK2与STAT3的磷酸化，并显著抑制IL-6、IFN-γ的表达。提示芦丁的抗炎作用可能与抑制JAK2-STAT3信号通路活化有关，但具体机制仍需进一步研究。

目前SLE治疗药物以糖皮质激素、免疫抑制剂和生物大分子为主，虽即刻有效，然而长期服用易产生耐药性，同时常见的并发症也会严重影响 SLE 患者的正常生活[22]。因此，研发更安全有效的抗SLE药物具有重要意义。芦丁作为常见植物中的常见成分，低毒安全，药理作用广泛，对SLE中的肾损伤和炎症反应具有较好的保护作用。其机制可能是通过抑制JAK2活化并阻断下游信号转导，阻碍相应的免疫应答。本研究显示，芦丁对SLE小鼠的肾损伤和炎症反应具有明显的改善作用，其机制可能与抑制JAK2激活有关。

综上所述，MRL/lpr小鼠肾脏出现严重病理性损伤，尿蛋白增多、肾功能受损严重，血清中抗体含量与促炎因子含量显著增加。而芦丁可能通过对JAK2-STAT3的抑制作用调节MRL/lpr小鼠的炎症反应，减轻肾损伤，改善肾功能。具体机制有待进一步证实。深入研究芦丁对SLE人群的保护作用将为临床防治SLE和并发肾损伤提供新的解决思路。