高甘油三酯对人主动脉平滑肌细胞凋亡和炎症因子的影响

蒲丽君，刘杰，胡厚祥

(川北医学院附属医院心血管疾病研究室，四川 南充 637000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS )是一种血管壁的慢性炎性疾病，是各种心血管疾病发生、发展的病理生理基础[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)作为动脉壁的主要成分，其凋亡[2]和炎症反应[3]在AS的发病及进展中发挥重要作用 。血脂异常与AS密切相关，其中高甘油三酯(HTG)是最常见的脂代谢异常。AS与甘油三酯(TG) 的代谢异常息息相关，对于动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD) 的风险评估有重要作用。但TG与ASCVD确切关系仍有争议，其机制尚未清楚。既往研究[4]指出中链甘油三酯对VSMCs增殖具有双向作用，但HTG对于VSMCs凋亡和炎症因子的影响目前研究较少。因此，本研究以HASMC 为研究对象，观察HTG对HASMC凋亡和炎症因子IL-6、TNF-α表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HASMC购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。甘油三酯(G1904231)购自Bomei，DMEM高糖培养基和胰酶购自美国 Hyclone 公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，MTT购自Biofroxx公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国 Sigma公司，放射性免疫沉淀评价(radio immunoprecipitation assay，RIPA)细胞裂解液和BCA蛋白浓度测定购自碧云天公司，增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购自Affinity公司，兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(A0208)、兔抗人胱天蛋白酶-3(Caspase-3，A0214)及兔抗人β-actin(AC026)抗体购自ABClone公司，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(ab6721)购自美国abcam公司。

1.2 实验分组及药物处理

将人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells，HASMC)分为对照组和实验组，实验组又分为TG 1 mmol/L组、2.5 mmol/L组和5 mmol/L组，实验组分别采用TG 1.0 mmol/L、2.5 mmol/L和5.0 mmol/L刺激细胞24 h。

1.3 MTT检测细胞增殖

收集对数生长期大鼠主动脉平滑肌细胞(rat aortic smooth muscle cell，RASMC)接种于 96 孔板(5×104个/孔),每组设置3个复孔。干预结束后，吸除培养液，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，室温避光孵育 5 min，用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的吸光值。细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白组OD值 )/(对照组OD值-空白组OD 值)]×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞调亡

取对数生长期的HASMC接种于6孔板(1×105个/孔)，设置组别对照组、1 mmol/一组、2.5 mmol/一组、5 mmol/一组，每组重复3次，干预24 h后，将上清液吸入15 mL离心管中，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞1次，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化收集细胞悬液，离心收集细胞沉淀，将细胞液移入1.5 mL EP管中，离心5 min，吸除上清液，PBS洗涤两次，用500 μL的Binding Buffer重悬细胞后，加入5 μL Annexin APC轻轻吹匀，再加入5 μL的碘化丙锭(PI)混匀；室温避光反应15 min，上机检测分析。

1.5 Western blot 检测Bcl-2和 Caspase-3 蛋白表达

HASMC干预24 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，然后通过蛋白质免疫印迹(WB)检测相关蛋白的表达水平。每个样品以20 μg蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)膜上，用 5% 脱脂牛奶溶液室温封闭2 h，分别加入一抗Bcl-2(1∶500)、Caspase-3(1∶2 000)和β-actin(1∶100 000)，在4 ℃ 摇床上孵育过夜，以用Tris-Hcl- NaCl-Tween 20缓冲液(TBST)将PVDF膜洗3次，每次5 min，将PVDF膜放入二抗(1∶5 000)中，摇床上轻摇，室温孵育2 h，用TBST再洗膜3次，每次5 min。用ECL发光剂显影。再用Image J软件分析条带灰度值，结果以Bcl-2/β-actin和Caspase-3/β-actin的比值表示。实验重复3次，取平均值。

1.6 ELISA检测白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平

收集各组细胞培养上清液，采用 ELISA 法检测IL-6、TNF-α 的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 TG对HASMC细胞增殖抑制的影响

与对照组比较，TG 1 mmol/L组抑制增殖率降低(P<0.05)，具有促进细胞增殖作用，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组增殖抑制率增加(P<0.05)，呈浓度依赖性。与TG 1 mmol/L组比较，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组增殖抑制率增加(P<0.05)，呈浓度依赖性。与 TG 2.5 mmol/L比较，TG 5 mmol/L组增殖抑制率增加(P<0.05)。见表1。

2.2 TG对RASMC凋亡的影响

与对照组比较，TG 1 mmol/L组凋亡率降低，差异无统计学意义(P>0.05)，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组凋亡率增加(P<0.05)，且TG 5 mmol/L组凋亡率高于TG 2.5 mmol/L组(P<0.05)； 与TG 1 mmol/L组比较， TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组凋亡率增加(P<0.05)。见表1及图1。

2.3 TG对Bcl-2、 Caspase-3 蛋白表达的影响

与对照组相比，TG 1 mmol/L组中Bcl-2蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组中Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)；与TG 1 mmol/L比较，TG 2.5 mmol/L组中Bcl-2蛋白表达降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，5 mmol/L组中Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。与对照组比较， TG 1 mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L组中Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)；与TG 1 mmol/L组比较，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组中Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)；与TG 2.5 mmol/L比较，TG 5 mmol/L组中Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。见图2及表2。

表1 不同组别细胞凋亡结果比较

表2 各组Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达水平比较

2.4 TG对炎症因子IL-6和TNF-α水平影响

与对照组相比，TG 1 mmol/L组上清液中IL-6和TNF-α浓度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，而TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L组中IL-6和TNF-α浓度均升高(P<0.05)；与TG 2.5 mmol/L比较，TG 5 mmol/L组中IL-6和TNF-α浓度升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞上清液中IL-6、TNF-α浓度比较

3 讨论

AS是各种心血管疾病发生、发展的病理生理基础，严重威胁着人类健康，发生机制复杂。VSMCs作为血管中膜的主要细胞类型之一，其增殖和凋亡的平衡贯穿AS全过程[5]。既往研究[6-8]多聚焦于VSMCs的增殖与迁移，而近年来，越来越多的研究表明AS的形成过程也与VSMCs等细胞的凋亡密切相关[9]。Clarke等[10]指出，对小鼠血管中膜和内膜的 VSMCs 进行凋亡诱导后，AS斑块中出现纤维帽变薄、细胞碎片堆积和内膜炎症等现象，VSMCs凋亡与AS斑块的不稳定性密切相关。AS患者的 VSMCs凋亡率高，与粥样斑块不稳定有关[11]。但是VSMCs凋亡与AS形成的具体机制尚未清楚。因此，深入研究其凋亡调控机制有望为AS的预防和治疗提供新的参考靶点。

HTG是临床上常见的一个全球性公共健康问题，它对各种心脑血管疾病的发生与发展都起着重要的作用。HTG是否是致AS和冠心病的独立危险因素是近年来该领域关注的热点，目前仍存在有争议。HTG血浆可促进VSMCs的增殖，减少凋亡[12-13]；但中链甘油三酯对大鼠血管平滑肌细胞的增殖具有双向作用[4]，即在低浓度短时间促进增殖作用，在中、高浓度抑制增殖作用，且凋亡可能与中链甘油三酯的抑制细胞增殖作用无关。Bcl-2/Casepas-3信号通路在调控细胞凋亡过程中至关重要，Bcl-2具有抗凋亡作用，Caspase-3活化后可促进细胞凋亡，且Bcl-2抑制Caspase-3的活性以减少细胞凋亡。本研究显示，中、高浓度TG可通过促进Casepas-3表达并抑制Bcl-2表达来促进HASMC凋亡，且具有浓度依赖性，但低浓度TG对HASMC凋亡无明显影响，即便其可促进HASMC增殖，究其原因可能与AS晚期斑块不稳定及炎症因子浸润等因素有关。

此外，炎症在AS的发生、发展中发挥重要作用[14]。TNF-α又称为前炎症细胞因子，是启动炎性反应最为重要的细胞因子，IL-6是一种具有多重效应细胞因子，在机体免疫代谢过程中起关键作用。本研究发现，中、高浓度TG可上调炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平，并且呈浓度依赖性，与既往研究[15-17]基本一致，TG促使AS病变晚期HASMC凋亡增加与炎症反应的程度有关。

综上，中、高浓度TG可通过促进Casepas-3表达及并抑制Bcl-2表达来促进HASMC凋亡，且具有浓度依赖性。