牛结核病γ-干扰素检测技术

2023-02-14

云南农业 2023年2期

1 技术概述

1．1 技术基本情况

牛结核病是由牛结核分枝杆菌引起的人畜共患慢性传染病。近年来，人结核病阳性检出率逐年上升，世界卫生组织在1993年4月宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申“遏制结核病的行动刻不容缓”，并将每年3月24日定为“世界防治结核病日”。据报道，约有10.6%的人结核病是由牛分枝杆菌引起的，牛结核病中的7%是由人结核杆菌引起。2002—2020年大理市共检测奶牛52 761头，检测出阳性404头，阳性率0.77%，奶牛结核病依然威胁着广大人民的健康。根据奶牛结核病检测技术标准，检测奶牛结核病的方法为单纯颈部皮内变态反应实验、比对颈部皮内变态反应实验和结核病γ-干扰素ELISA实验。皮内变态反应实验非特异性反应较高容易造成误杀，而且耗费人力、财力和时间较多，存在人为因素影响结果的准确性等现象。结核病γ-干扰素ELISA实验敏感性和特异性较皮内变态反应都高，是检测奶牛结核病的最佳方法。

1．2 示范技术推广情况

结核病γ-干扰素ELISA实验已写入奶牛结核病检测技术标准，适合大范围推广，在新疆、内蒙古、山西等省（市）均有推广。

1．3 提质增效情况

2021年大理市动物疫病预防控制中心在规模化养殖场用结核病γ-干扰素ELISA、结核分枝杆菌ELISA、结核病对比皮内变态反应实验3种方法进行牛结核病检测净化，累计监测374头，共检出结核病阳性畜25头。经评估，排除可疑结果50头，排除假阳性34头，降低了49.57%的成本，为农户挽回经济损失60万元以上。牛结核病γ-干扰素检测技术可快速准确诊断牛结核病，为牛结核病防控提供科学依据。

2 技术要点

2．1 实验基础条件

（1）实验室基础建设。实验室要通过兽医实验室认证，具备开展奶牛结核病检测等实验的条件和资质，有足够的面积，相对独立功能区，配备酶标仪、自动洗板机、微量震荡器、生物安全柜、普通离心机、生物显微镜、恒温培养箱、生化培养箱、PCR仪等齐全的血清学检测及核酸检测仪器设备，基本达到实验操作要求标准及生物安全标准。

（2）实验室管理体系。要求有完善的管理体系，制定《质量管理手册》《生物安全管理规定》《兽医实验室生物安全管理手册》《程序文件》《实验室安全保卫制度》《实验室废弃物处理制度》《实验室人员准入制度》《实验室生物安全人员培训、考核制度》《实验室生物安全自查制度》《实验室消毒管理制度》《兽医实验室生物安全管理制度》《兽医实验室生物安全管理手册》《兽医实验室生物安全应急预案》《兽医实验室意外事故应急处置措施》等一系列制度措施，并不断完善各项管理制度。

（3）实验室检测能力。兽医实验室要求有固定的专职技术人员，可开展酶联免疫吸附试验（ELISA）、血清学检测、实时荧光PCR、细菌分离、培养、鉴定，血常规检查、血液生化指标检查、尿液常规检查等。

2．2 结核病γ-干扰素ELISA实验简介

（1）参照标准及适用范围。参照《动物结核病诊断技术》GB/T 18645—2020。用于检测牛全血培养上清中的牛γ-干扰素，根据检测牛PPD、禽PPD和PBS刺激全血后上清中γ-干扰素量的不同判断牛结核的感染情况。

（2）实验原理。牛γ-干扰素实验是以刺激培养全血为基础，检测牛结核病的一种实验方法。通常感染分支杆菌的牛，其血液中的淋巴细胞能识别特异的分支杆菌抗原（包括结核菌素PPD），淋巴细胞识别分支杆菌抗原的过程涉及细胞因子的产生和释放，γ-干扰素就是其中最重要的一种。用结核菌素(PPD)刺激培养牛全血，全血中的T淋巴细胞就会识别PPD，发生细胞免疫反应，其中一个直接的表现就是产生并释放γ-干扰素。γ-干扰素可用γ-干扰素特异的单克隆抗体夹心法检测。其他资料背景参考《牛γ-干扰素ELISA检测试剂盒》的说明书。

（3）操作程序及安全性。实验存在一定风险，但风险较小。阳性反应的上清中可能含有分支杆菌，要求所有操作步骤严格遵守操作规程及实验室生物安全相关规章制度。

器材包括酶标仪、Ⅱ级生物安全柜、二氧化碳培养箱或生化培养箱、混匀仪、冰箱（2～8 ℃或-15 ℃以下）、电子天平、高压消毒锅、微量可调移液器及吸头、一次性无菌离心管（2 mL或1.5 mL）、一次性肝素锂或肝素钠抗凝采血管、一次性注射器（5 mL、10 mL、20 mL）或一次性采血针、一次性无菌注射器等。

试剂为《牛γ-干扰素ELISA检测试剂盒》、去离子水等。

操作方法：①抗凝血采集。用采血针或注射器无菌采集全血4 mL以上，立刻转移至肝素锂或肝素钠抗凝采血管中，轻轻颠倒混匀3～5次，18～25 ℃保存，30 h内送达实验室进行刺激培养。②全血培养。将抗凝血轻轻颠倒混匀，无菌分装于培养容器，每份血液样品分装3孔，每孔加入定量全血，分别加入定量PPD-B、PPD-A和PBS，轻轻振荡混匀，置37 ℃培养一定时间，收集上清，立即用于检测，或保存于-15 ℃以下备用。③ELISA检测。用ELISA方法检测上清液中的γ-干扰素。④分析数据。根据试剂盒说明调整酶标仪波长，读取OD值，确定实验结果成立与否，判定阴阳性。

2．3 结核病γ-干扰素ELISA实验推广应用

2021年在规模化养殖场推广结核病γ-干扰素ELISA实验，发现结核病γ-干扰素ELISA实验在实际应用中优势明显，同时也存在一定的不足，因此通过进一步推广探索出更优化的结核病γ-干扰素ELISA实验及相关推广方式。

（1）结核病γ-干扰素ELISA实验，1个实验周期约24 h，通过推广探索缩短实验周期的方法。

（2）结核病γ-干扰素ELISA实验技术要求用去离子水，通过推广探索使用市面上售卖的饮用纯净水替代去离子水，使该实验方法更容易在基层应用。

（3）通过结核病γ-干扰素ELISA实验不同试剂盒实验结果比对，筛选出敏感性和特异性更高的试剂盒。

（4）通过推广，探索出结核病γ-干扰素ELISA实验关键细节，通过改进，优化实验方法及推广方式。

3 适用区域

技术适用于在大理市乃至大理州牛规模化养殖场（户）推广应用。

4 注意事项

一是采血过程注意生物安全，尤其注意个人防护及全血不得污染。二是全血应低温保存，不能污染、腐败、冷冻。三有相关实验室及实验设备的配套。四是培养全血时应注意温度要恒定在37 ℃，要防止污染。五是做ELISA洗板时，在拍干后不能留有气泡，不能长时间干燥。六是显色时应注意避光，加样后应注意混匀。七是注意记录的完整性与规范性，做到有痕迹资料可追溯。