子宫颈癌及癌前病变中E6/E7 mRNA的表达水平及与HR-HPV感染的相关性分析

刘丹丹 孙健 邬剑

子宫颈癌属常见的妇科恶性肿瘤，其发病率、死亡率仅次于乳腺癌，随着临床对子宫颈癌的研究逐渐深入，发现该疾病的发生与癌基因表达异常、病毒感染、性生活混乱、早婚早育、不良生活习惯等多种因素相关[1]。有报道称，高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）感染在子宫颈癌中较为普遍，HR-HPV 持续感染会引发子宫颈细胞由正常状态转化为恶性病变，最终诱发子宫颈癌前病变、子宫颈癌[2]。HR-HPV 包括多种类型，其中以HPV16、HPV18 型最为常见，但临床上对HPV 的检测目的在于筛查出高危病变人群，并非筛查HR-HPV 感染[3]。因此寻找与HR-HPV感染相关的分析标记物，对子宫颈癌及癌前病变预测较为重要。研究认为，HPV 基因组中E6/E7 所编码的E6、E7 蛋白具有诱发子宫颈上皮细胞癌变的作用[4]。基于上述背景，本次研究分析了HPV 基因组E6/E7mRNA 和HR-HPV 感染的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年2 月-2021 年2 月于佳木斯市妇幼保健院确诊的43 例子宫颈癌患者作为子宫颈癌组，66 例癌前病变患者作为癌前病变组，另外同期选取于本院首次确诊的80 例慢性子宫颈炎患者作为子宫颈炎组。纳入标准：子宫颈癌组符合子宫颈癌诊断标准；癌前病变组符合子宫颈癌前病变诊断标准；子宫颈炎组符合单纯子宫颈炎诊断标准，且首次确诊。排除标准：处于月经/妊娠期/哺乳期；合并心肺等功能障碍；合并其他恶性肿瘤；伴精神疾病；语言表达、听力异常。本项研究经过医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意，自愿参加。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有研究对象均做宫颈活检，取子宫颈组织，备用。

1.2.2 E6/E7 mRNA 检测 取子宫颈组织样本，分离出宫颈上皮细胞；用2 mL 双蒸水混悬细胞，加入3 μL 蛋白酶K、300 μL 组织裂解液，在65 ℃的环境温度下孵育0.5 h，终止反应；使用美国Diacarta 公司生产的QuantiVirus TM 便携式冷光仪读取E6/E7 mRNA 拷贝数。阳性标准：拷贝数＞0。取宫颈组织样本，采用免疫组化法测定E6/E7 蛋白阳性表达情况。阳性标准：细胞核中出现棕黄色颗粒。

1.2.3 HR-HPV 感染测定 采用实时荧光定量PCR法检测HR-HPV 感染情况。阳性标准：病毒载量≥103copies/mL。

1.2.4 E6/E7 mRNA 与HR-HPV 感染的相关性 根据HR-HPV 载量高低分为中低载量（103copies/mL≤HR-HPV 载量≤106copies/mL）、高载量（106copies/mL＜HR-HPV 载量≤107copies/mL）、超高载量（HRHPV 载量＞107copies/mL）三个等级。将癌前病变组66 例患者、子宫颈癌组43 例患者根据HR-HPV载量高低分为中低载量组、高载量组、超高载量组三个亚组，对比三个亚组间E6/E7 mRNA 表达水平，并分析两者的关系。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析处理。计量资料以（x-±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料用率（%）表示，采用χ2检验。相关性采用Pearson 相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料对比 子宫颈炎组平均年龄（39.22±3.65）岁，平均体重指数（body mass index，BMI）为（23.87±2.20）kg/m2，孕产次≥2 次23 例，＜2 次57 例。癌前病变组平均年龄（38.94±3.43）岁，平均BMI（23.01±2.31）kg/m2，孕产次≥2 次15 例，＜2 次51 例，子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）分 期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期25 例，Ⅲ期22 例。子宫颈癌组平均年龄（38.42±3.75）岁，平均BMI（23.26±2.17）kg/m2，孕产次≥2 次18 例，＜2 次25 例，临床分期：Ⅰ期10 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期14 例。三组年龄、BMI、孕产次等一般资料对比，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 三组E6/E7 mRNA 表达情况对比 三组E6/E7 mRNA 阳性率、拷贝数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；子宫颈癌组E6/E7 mRNA 阳性率、拷贝数均高于癌前病变组、子宫颈炎组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；癌前病变组E6/E7 mRNA 阳性率、拷贝数均高于子宫颈炎组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 E6、E7免疫组化图（SP，×100）

表1 三组E6/E7 mRNA表达情况对比

2.3 E6/E7 mRNA 与癌前病变组、子宫颈癌组患者疾病分期的关系分析 E6/E7 mRNA 与癌前病变组患者CIN 分期有关，Ⅲ期患者E6/E7 mRNA拷贝数高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（F=148.069，P＜0.001）。E6/E7 mRNA 与子宫颈癌组临床分期有关，Ⅳ期患者E6/E7 mRNA 拷贝数高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者，差异均有统计学意义（F=192.731，P＜0.05）。见表2。

表2 E6/E7 mRNA与癌前病变组、子宫颈癌组患者疾病分期的关系分析

2.4 三组HR-HPV 感染情况对比 子宫颈癌组HR-HPV 感染阳性率、病毒载量均高于癌前病变组、子宫颈炎组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。癌前病变组HR-HPV 感染阳性率、病毒载量高于宫颈炎组，均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三组HR-HPV感染情况对比

2.5 癌前病变组、子宫颈癌组中HR-HPV 不同病毒载量分布情况分析 癌前病变组中HR-HPV 病毒中低载量11 例（24.44%）、高载量7 例（15.56%）、超高载量27 例（60.00%）；子宫颈癌组中HRHPV 病毒中低载量5 例（12.50%）、高载量11 例（27.50%）、超高载量24 例（60.00%）。两组均以HR-HPV 超高载量占比最高。

2.6 子宫颈癌及癌前病变中E6/E7 mRNA 与HRHPV 感染的相关性分析 中低载量组、高载量组、超高载量组的HP-HPV 病毒载量和E6/E7 mRNA 比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。超高载量组HP-HPV 病毒载量和E6/E7 mRNA 均高于高载量组、中低载量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。相关性分析显示，E6/E7 mRNA 与HR-HPV之间关系为正相关（r=0.431，P＜0.001）。

表4 E6/E7 mRNA与HR-HPV感染的相关性（）

表4 E6/E7 mRNA与HR-HPV感染的相关性（）

*与超高载量组比较，P＜0.05。

3 讨论

目前用于诊断子宫颈癌的生物标志物较多，主要包括HR-HPV 核酸、HPV 蛋白等，部分学者认为，子宫颈癌及癌前病变中应用HR-HPV 诊断具有较高的敏感性[5]，但随着其逐渐应用发现，因宿主免疫系统的清除作用，HR-HPV 感染多短暂，诊断准确性并不理想[6-7]。为了弥补上述缺点，近几年提出了多种诊断子宫颈病变的生物标记物，包括特定蛋白检测、特定基因甲基化检测、HPV 病毒基因和宿主细胞基因组整合状态检测及HPV 相关基因组检测等，其中以E6/E7 研究较多[8]。在上述背景下，本文进一步分析验证，子宫颈癌及癌前病变中E6/E7 mRNA 表达水平及与HR-HPV 感染的相关性，以提高临床对子宫颈病变诊断的准确性。

HR-HPV 中主要的功能调节蛋白均位于基因组E 区，包 括E1、E2、E4、E5、E6、E7 等[9-10]。其中E6 具有致癌作用，引发子宫颈上皮细胞异常的途径较多，其中最为经典的途径为与E6 蛋白结合，经调解p53 癌基因的表达，促使p53 降解、失活，最终促进细胞癌变[11-13]。在HR-HPV 感染后，E7可与pRb 蛋白发生结合作用，促进细胞周期中G1进入S 期所需基因的转录，进而经扰乱子宫颈上皮细胞正常的生物学行为，促使细胞恶性增殖[14-16]。研究发现，HR-HPV 感染后将E6/E7 DNA 整合至宫颈上皮细胞基因组中，诱导E6/E7 基因表达，激活对应的转导通路，进而诱导子宫颈癌变[17]。因此临床研究认为，正常子宫颈转变为子宫颈癌前病变、子宫颈癌共需要以下几个阶段，HR-HPV游离感染、整合感染、整合感染转录活动期、整合感染翻译活动期及细胞形态改变期，E6/E7 全程参与上述过程[18-20]。本文结果显示，E6/E7 在不同宫颈病变中表达不同，在子宫颈癌前病变、子宫颈癌中的表达明显高于子宫颈炎患者，且子宫颈癌患者E6/E7 mRNA 表达高于癌前病变患者，此结果提示，E6/E7 参与子宫颈癌变过程，其表达升高可能与HR-HPV 持续感染后E6/E7 表达被激活有关。

临床有报道称，当HR-HPV 感染子宫颈上皮细胞后，癌基因E6/E7 无限复制，处于活跃期，子宫颈癌变的风险显著升高[21-22]。本文结果显示，HRHPV 载量不同E6/E7 mRNA 表达不同，其载量越高E6/E7 mRNA 表达水平越高，分析其原因可能与HR-HPV 持续感染过程中，子宫颈上皮细胞癌变，癌基因E6/E7 表达较为强烈，进而促进子宫颈癌的形成相关。本文进一步分析两者之间的关系，结果发现，两者表现为正相关，在一定程度上证实了上述结论。

虽然本文分析了子宫颈癌及癌前病变中E6/E7 mRNA 与HR-HPV 感染的关系，但并未具体研究两者间相关的作用机制，且本次所纳入的样本量较少，在数据统计时可能存在一定的偏倚，因此还需进一步加大样本量深入研究分析，以期望为临床上子宫颈癌及癌前病变的筛查提供参考。

综上所述，E6/E7 mRNA 在子宫颈癌及癌前病变中表达水平明显升高，与癌前病变相比，在子宫颈癌中表达更高，且与HR-HPV 感染密切相关。