孕酮对鲫鱼胚胎发育和内分泌干扰效应

2023-02-13王晨满晓婷王颖张云紫周新雨万汝燕夏晓华

四川动物 2023年1期

王晨，满晓婷，王颖，张云紫，周新雨，万汝燕，夏晓华

（河南师范大学生命科学学院，河南新乡453007）

内分泌干扰物是一类激素类环境污染物，类固醇激素被认为是内分泌干扰物中最活跃的药物类别之一，极少量残留即可影响水生脊椎动物的繁殖和发育。作为一类重要的类固醇激素，孕激素具有调节内分泌与生殖周期的功能。孕酮（P4）是一种典型的孕激素，它被广泛用于人类激素替代疗法、避孕药的制作和其他医疗应用（Lianget al.，2015），还被广泛应用于畜牧养殖业，以提高动物产量和相关的经济效益。P4会以粪便和尿液的形式进入污水处理厂，由于不能被完全去除，其在水体中的残留往往超过正常范围，给水生生物带来了潜在的严重风险。污水处理厂废水中的P4浓度为4.5～24.8 ng·L-1（Yarahmadiet al.，2018），猪场和奶牛场废水中的P4浓度高达3 470～11 900 ng·L-1（Liuet al.，2012）。

环境中较低的P4残留即可影响生物体内源激素的合成、分泌和代谢，干扰机体内环境的稳态平衡，进而影响生物体正常的生长、发育和繁殖过程。在3.5～306 ng·L-1的P4中暴露14 d，雌性斑马鱼Danio rerio的卵母细胞加速成熟且卵巢受到生理性损伤（Zucchiet al.，2013）。Wang等（2020）研究发现，在50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4处理下，雄性鲫鱼Carassius auratus的精巢中出现卵原细胞，高浓度P4暴露组有更多的雌鱼产生，使鲫鱼性别比偏向雌性。鱼类的生殖活动受下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary gonadal，HPG）轴的调节，Hou等（2018）发现斑马鱼在幼鱼阶段接触炔诺酮可能会影响性腺分化和性别比例，并归因于HPG轴基因表达的改变。Zhao和Fent（2016）的研究表明，昼夜节律可以调节HPG轴相关活动及各种重要的生物过程。因此，HPG轴和昼夜节律相关基因的表达改变可能干扰鱼类的性腺发育，进而影响其繁殖。

鱼类是低等的水生生物，其性腺发育和性别决定方式易受外界环境内分泌干扰物的影响。杨倩等（2021）研究发现，双酚F能导致下丘脑-垂体-甲状腺轴、HPG轴和下丘脑-垂体-肾上腺轴上一系列基因的表达水平发生改变，进而影响斑马鱼的内分泌功能。Zeilinger等（2009）发现在0.8 ng·L-1环境浓度水平的左炔诺孕酮影响下，雌鱼的卵细胞结构及卵巢发育发生显著改变。因胚胎相较于成鱼和幼鱼对污染物更敏感（Nagel，2002），本文以鲫鱼胚胎为实验对象，讨论P4对鲫鱼胚胎发育以及其对昼夜节律和HPG轴相关基因表达的影响，从而揭示P4对鱼类早期胚胎的生态毒理学效应。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

孕酮标准品购自上海成捷化学有限公司，将其溶解在100%乙醇中用作储备溶液（1 mg·mL-1），然后用脱氯自来水稀释以获得实验浓度。4 ℃避光保存。

1.2 实验动物

鲫鱼购自河南师范大学水产学院水产养殖中心，置于200 L水箱中用曝气自来水驯养1周。随机挑选健康性成熟的亲鱼，用干法人工授精获取受精卵。将正常发育的囊胚期胚胎随机分配到直径为180 mm的培养皿，每个培养皿中均匀分布300～500个胚胎，暴露处理144 h，至所有胚胎全部孵出。

1.3 P4毒性暴露实验设计

一部分培养皿暴露于浓度为10 ng·L-1、100 ng·L-1、1 000 ng·L-1、10 000 ng·L-1的 P4、0.001%乙醇和曝气自来水（空白对照组）中处理144 h，倒置显微镜下观察胚胎的发育状况，记录死亡数、孵出数和畸形数，并选择异常个体进行拍照；另一部分培养皿暴露于浓度为5 ng·L-1、50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4和曝气自来水（空白对照组）中处理144 h（乙醇溶剂终浓度低于1‰，且空白对照组和乙醇溶剂组结果不存在显著差异，因此仅保留空白对照组），同时在暴露24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和 144 h时从每组随机挑选20～30个胚胎，保存于液氮中。以上所有实验均设置3个重复。每隔24 h更换暴露溶液，在整个实验过程中，所有胚胎均维持在（26±1） ℃的温度下，并进行光照∶黑暗（14 h∶10 h）循环。

1.4 基因转录水平分析

使用 Total RNA extraction reagent（TaKaRa）对鲫鱼胚胎进行总RNA提取，琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测RNA的完整性和纯度，使用Prime Script逆转录酶（TaKaRa）进行cDNA合成。利用Primer Premier 5和Oligo 7对本实验中所要研究的基因进行特异性引物设计，在LightCycler®96实时荧光定量PCR仪中进行qRT-PCR。25 μL反应体系包括：12.5 μL 2×TransStart®Top/Tip Green qPCR SuperMix，上、下游引物（表 1）各 0.5 μL，1 μL cDNA 和10.5 μL ddH2O，反应程序为：94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s（45×）；94 ℃ 10 s，65 ℃60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。选取了昼夜节律相关的6 个基因Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1，HPG轴相关基因Gnrh2、Gnrh3、Fshβ、Lhβ和类固醇生成相关基因Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β，检测其转录表达水平。选40S rRNA为管家基因，实验重复3次。使用LightCycler®96 SW1.1分析数据，所得数据采用 2-ΔΔCt计算。

1.5 数据分析

所有数据均以xˉ±SD表示，并用SPSS 16.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。统计学显著性差异水平设置为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 P4暴露对鲫鱼胚胎形态发育的影响

胚胎毒性实验显示，P4对鲫鱼早期胚胎形态发育没有明显的致死、致畸效应（图1）。在整个暴露过程中，空白对照组、0.001%乙醇对照组和4个浓度P4暴露组中的鲫鱼胚胎在144 h后全部孵出，存活率分别为82.61%、78.41%、81.08%、75.63%、80.33%和82.80%，没有显著差异；畸形率分别为4.10%、3.70%、5.20%、3.90%、4.67%和5.07%。

图1 P4对鲫鱼早期胚胎形态发育的影响Fig. 1 Effects of P4 on morphological development in early embryos of Carassius auratus

2.2 P4对鲫鱼早期胚胎发育过程中昼夜节律相关基因表达的影响

与空白对照组相比，5 ng·L-1或更高浓度的P4暴露组中，从24 h到144 h，Clock1和Arntl1基因的表达水平整体呈先升高后降低再升高的趋势（图2：A、B）；Cry1基因的表达水平在48 h和96 h上调（图2：C）；Cry2和Nr1d1基因的表达水平在24 h、120 h和144 h显著上调，而在72 h和96 h被抑制（图2：D、E）；Per2基因的表达水平在24～96 h被抑制，但120 h后又上调（图2：F）。

图2 P4对鲫鱼胚胎发育过程中昼夜节律相关基因表达水平的影响Fig. 2 Effects of P4 on the expression levels of circadian rhythm related genes during the embryonic development of Carassius auratus

2.3 P4对鲫鱼早期胚胎发育过程中HPG轴相关基因表达的影响

与空白对照组相比，P4暴露组中Gnrh2基因的表达水平在96 h显著降低；而5 ng·L-1P4暴露24 h、48 h和120 h， 50 ng·L-1P4暴露24 h、72 h、120 h和144 h以及100 ng·L-1P4暴露144 h后，Gnrh2基因的表达水平均显著升高（图3：A）。P4暴露组中，Gnrh3基因的表达水平在96 h受到了显著诱导，而在120 h和144 h被显著抑制（图3：B）。P4暴露组在 72 h 以及 100 ng·L-1P4处理144 h时，Fshβ基因的表达水平显著提高，而在其他大多数时间点被显著抑制（图3：C）。此外，与空白对照组相比，5 ng·L-1P4暴露处理24 h、120 h，50 ng·L-1P4暴露处理120 h以及100 ng·L-1P4暴露处理144 h后，Lhβ基因的表达水平显著上调（图3：D）。

图3 P4对鲫鱼胚胎发育过程中下丘脑和垂体激素相关基因表达水平的影响Fig. 3 Effects of P4 on the expression levels of hypothalamus and pituitary hormone-related genes during the embryonic development of Carassius auratus

与空白对照组相比，5 ng·L-1或更高浓度的P4处理72 h以及100 ng·L-1P4处理120 h显著抑制Cyp11a基因的表达；而在24 h、48 h和96 h，Cyp11a基因的表达水平显著提高（图4：A）。在24 h和144 h，不同浓度P4暴露显著提高Cyp19a基因的表达；而在72 h则被显著抑制（图4：B）。Hsd3β基因经50 ng·L-1和100 ng·L-1P4暴露处理24 h、100 ng·L-1P4暴露48 h以及5 ng·L-1P4暴露144 h，表达水平显著提高；而在72～120 h则显著降低（图4：C）。不同浓度P4暴露24 h和96 h后，Hsd20β基因的表达水平显著降低；而在72 h，Hsd20β基因的表达水平显著提高（图4：D）。

图4 P4对鲫鱼胚胎发育过程中与类固醇激素相关基因表达水平的影响Fig. 4 Effects of P4 on the expression levels of steroid hormone related genes during the embryonic development of Carassius auratus

3 讨论

胚胎毒性实验表明，P4浓度梯度对鲫鱼早期胚胎形态发育没有明显的急性毒性。梁燕秋（2016）发现，暴露于10～10 000 ng·L-1P4的斑马鱼胚胎未出现死亡、畸形的情况，与本研究结果一致。胚胎是鱼类发育最敏感、最脆弱、最关键的阶段，胚胎的正常发育是鱼体生长和繁殖的基本保障，因此，本文进一步研究了较低浓度P4对鲫鱼胚胎的内分泌干扰效应。

昼夜节律是生物体为了适应地球自转引起的以24 h为周期的行为、代谢、免疫等方面节律性变化，它由多个正、负调节因子组成的自我维持的反馈回路组成。Clocks、Arntls、Pers、Crys、Nr1ds构成了昼夜节律调控网络的核心。转录因子Clocks和Arntls是这些反馈回路的正向组件，可以激活核心昼夜节律基因——周期（Pers）和隐花色素（Crys）的转录，而Per和Cry又可以与Clock/Arntl1异二聚体相互作用，抑制异二聚体的活性。此外，Clocks/Arntls异二聚体还激活核受体基因Nr1ds的转录（Albrecht & Eichele，2003）。Nr1d1的表达可抑制Arntl1、Pers和Crys转录，从而调节昼夜节律。Zhao等（2015）研究发现，孕激素能改变斑马鱼中昼夜节律及其下游信号通路的基因表达水平。Xia等（2019）发现，孕酮能影响黄河鲤Cyprinus carpiovar.幼鱼中昼夜节律相关基因表达，进而导致内分泌系统的紊乱。本研究中P4暴露影响了昼夜节律信号通路相关基因（Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1）的表达，这与Zhao和Fent（2016）在斑马鱼中的研究结果类似。

昼夜节律可以驱动各种关键细胞和生理过程的日常振荡，如细胞周期及其调节、激素分泌、甚至繁殖等（Bedrosianet al.，2016；Zhaoet al.，2018；Zhenget al.，2018），且Zhao和Fent（2016）研究发现昼夜节律能够调节HPG轴的活动。HPG轴参与调节一系列生殖活动，促进和控制生殖细胞的起源、性别分化、性腺的发育和成熟。促性腺激素释放激素（GnRH）在HPG轴中起关键作用。在HPG轴的cAMP级联反应中，GnRH与垂体前叶促性腺激素细胞表面的跨膜受体结合，触发级联反应来调控Lhβ和Fshβ表达（Guoet al.，2003；Pawson ＆ Mcneilly，2005）。黄体生成素（LH）和卵泡生成素（FSH）控制性腺中的类固醇生成和配子发生，因此GnRH介导中枢神经系统对生殖的控制。这个过程中任何一个基因表达量的改变都可能会导致整个HPG轴的紊乱，进而影响机体的正常生长发育。本研究发现，P4处理后，Gnrh2、Gnrh3的表达水平与Fshβ、Lhβ的相一致。推测Gnrh2和Gnrh3的显著上调可能增强了Lhβ和Fshβ的表达，从而提高FSH和LH的激素水平，并进一步调节类固醇生成基因（Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β）的表达。

Cyp11a具有侧链裂解活性，能催化胆固醇转化为孕烯醇酮（Guoet al.，2003），在Hsd3β的催化作用下，孕烯醇酮或脱氢表雄酮能生成有活性的孕酮和雄烯二酮（Kruschet al.，1979）。Cyp19a在体内可催化雄烯二酮向雌二醇转化，因而又称雌激素合成酶。Walsh等（2000）研究发现LH主要通过激活Hsd20β和促进17α，20β-二羟化酮受体的转运来促进精子和卵子的发育。本研究发现，3个不同浓度P4组处理72 h后，Fshβ的表达水平显著上调；Cyp11a在5 ng·L-1P4处理96 h和120 h以及50 ng·L-1P4 处理 120 h 显著上调；5 ng·L-1P4暴露144 h后，Cyp19a和Hsd3β的表达水平上调。这表明激活的FSH促进了Cyp11a、Hsd3β和Cyp19a的表达。Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β和Hsd20β是控制类固醇生成的关键基因，这些基因的表达改变可降低或提高类固醇激素的合成效率。实验室前期对暴露结束后相同P4浓度处理条件下生长至6个月的鲫鱼的性别比进行了统计分析，与对照组相比，高浓度P4暴露组诱导更多雌鱼产生。性腺组织学分析发现，在暴露于 50 ng·L-1和100 ng·L-1的鲫鱼精巢中观察到了卵母细胞的存在（Wanget al.，2020）。这些结果说明P4可能通过干扰类固醇合成途径来影响鲫鱼的胚胎发育，进一步影响鲫鱼幼鱼和成鱼的性腺发育和性别比例。