宫颈鳞癌组织中miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B细胞核内蛋白水平与高危型HPV感染的相关性研究*

黄玺瑞 廖艳芳 唐 剑 邹伟文 任 洁 宋楚莹 朱 正

广东省深圳市龙岗中心医院 1 病理科 2 妇产科 518000

宫颈鳞癌属于临床上较为常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，具有较高的发病率以及死亡率，已成为严重威胁女性生命健康安全的重大疾病之一，受到国内外的重点关注[1-2]。人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属，其中HPV16、18属于高危型HPV，若出现持续感染，会增加宫颈癌发生的风险，亦是宫颈癌发生的关键因素之一[3-4]。宫颈细胞学以及高危型HPV检测是目前临床上用以筛查宫颈癌的重要手段，但两者均有灵敏度以及特异度相对不高的局限性。微小RNA-26a(microRNA-26a，miR-590-3P)是近年来所发现的一种miRNA，可能通过靶向调控多种下游基因或(和)蛋白的表达，继而对多种肿瘤细胞的迁移以及侵袭产生影响，介导了宫颈癌的发生、发展过程[5]。另有免疫组织化学检测发现，叉头盆蛋白质M1(Fork head basin protein M1，FoxM1)及细胞分裂周期因子25B(Cell division cycle factor 25B，Cdc25B)可能在人宫颈癌以及癌前病变组织中存在异常表达[6]。鉴于此，本文通过研究宫颈鳞癌组织中miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B细胞核内蛋白水平与高危型HPV感染的相关性，旨在为临床宫颈鳞癌的早期诊断提供新的靶点和思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2014年2月—2019年12月医院通过宫颈活检、锥切以及子宫切除获取的宫颈组织标本300份纳入研究。将其按照疾病类型的差异分作正常组织59例，宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)1组织62例，CIN2/3组织101例，宫颈鳞癌组织78例。入选标准[7]：(1)所有受试者既往均无其他恶性肿瘤疾病史；(2)正常组织来源均为既往无宫颈癌或CIN病史，且无细胞学异常病史者；(3)年龄≥20岁；(4)入院前均未接受相关治疗；(5)所有受试者均进行为期6个月的随访观察。剔除标准：(1)合并严重感染性疾病、全身免疫系统疾病者；(2)神志异常或合并神经系统疾病者；(3)参与其他研究者；(4)研究过程中因各种原因退出或失访者。研究对象均在同意书上签字，获得医院伦理委员会批准，审批号为20140403。

1.2 研究方法 (1)采用实时荧光定量PCR检测不同组织中的miR-590-3P表达水平：取不同宫颈组织100mg于液氮内研磨成粉，以Trizol一步法完成RNA的提取，并以异丙醇法进行RNA的浓缩，采用分光光度计测定总RNA纯度，加权变性凝胶电泳检测总RNA质量。严格遵循实时荧光定量PCR试剂盒完成扩增。反应条件如下：95℃预变性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共40个循环。以2-ΔΔCt法表示miR-590-3P表达水平。其中miR-590-3P引物购自上海生工生物工程有限公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自北京鼎国公司。(2)以免疫组织化学法检测FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况：对组织进行常规石蜡包埋，并做厚度为3μm的连续切片，常规脱蜡水化，以EnVsion+两步法以及二氨基联苯胺显色，分别滴加一抗、二抗，具体操作遵循相关说明书完成。其中一抗、二抗均购自丹麦DAKO公司。(3)基因型HPV DNA的检测：采用中国国家药品监督管理局所推荐的聚合酶链反应—反向点杂交法HPV基因分型检测试剂盒完成，具体操作务必遵循试剂盒说明书完成，相关试剂盒购自亚能生物技术有限公司，共可检测23种HPV亚型。

1.3 观察指标 比较不同宫颈组织中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况，高危型HPV感染情况。分析宫颈鳞癌组织中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况与高危型HPV感染的相关性，以及miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白诊断CIN2+效能的ROC曲线。

2 结果

2.1 不同宫颈组织中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况评价 CIN2/3组织以及宫颈鳞癌组织中的miR-590-3P表达水平均高于正常组织、CIN1组织，且CIN1组织中的miR-590-3P表达水平高于正常组织(F=46.873，P=0.000)；CIN2/3组织以及宫颈鳞癌组织中的FoxM1蛋白阳性率及Cdc25B蛋白阳性率均高于正常组织以及CIN1组织，且CIN1组织中的FoxM1、Cdc25B蛋白阳性率均高于正常组织(χ2=47.293、51.041，P=0.000、0.000)，见表1。

表1 不同宫颈组织中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况评价

2.2 不同宫颈组织中高危型HPV感染情况评价 CIN2/3组织以及宫颈鳞癌组织中的高危型HPV感染率均为100.00%，明显高于正常组织、CIN1组织，且CIN1组织中的高危型HPV感染率为59.68%，明显高于正常组织的22.03%(χ2=67.293，P=0.000)，见表2。

表2 不同宫颈组织中高危型HPV感染情况评价

2.3 miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况与高危型HPV感染的相关性分析 经Spearman相关性分析可得：宫颈鳞癌组织中miR-590-3P、FoxM1、Cdc25B蛋白表达率均和高危型HPV感染呈正相关(P均<0.01)，见表3。

表3 宫颈鳞癌组织中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表达情况与高危型HPV感染的相关性分析

2.4 miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白诊断CIN2+效能的ROC曲线分析 经ROC曲线分析发现：miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白联合检测诊断CIN2+的曲线下面积、灵敏度、特异度分别为0.884、0.90、0.88，均高于上述三项指标单独检测，见表4。

表4 miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白诊断CIN2+效能的ROC曲线分析

2.5 高危型HPV感染影响因素的Logistic回归分析 经Logistic回归分析发现：高危型HPV感染的独立危险因素涵盖年龄、性伴侣人数以及生殖道炎症(均P<0.05)。见表5。

表5 高危型HPV感染影响因素的Logistic回归分析

3 讨论

随着近年来相关研究的不断深入，越来越多的学者认为宫颈鳞癌的发生主要危险因素涵盖以下几点[8-10]：(1)性行为：若女性开始性生活的年龄较小，或是在身体尚未完全发育成熟的情况下开始性生活，会对其子宫造成严重的损害。(2)月经和分娩：包括经期阶段不注重个人卫生、经期不稳定以及早婚、早育、多产等。(3)性生活：通过性生活而传播的疾病极易引起女性发生宫颈炎症，如不予以及时有效的治疗会对宫颈造成长期刺激，继而增加了宫颈癌发生风险。(4)吸烟：烟草中所含有的尼古丁会导致女性机体对外界感染的抵抗力下降，从而影响其对HPV感染的清除，诱发宫颈癌的发生。然而，高危型HPV感染是引起宫颈上皮内瘤变以及宫颈癌发生的重要因素，应予以足够的重视[11-13]。

miR-590-3P作为一种新近发现的miRNA，其抑癌基因的作用已在胃癌以及肺腺癌等多种恶性肿瘤中得以佐证[14-15]。FoxM1作为转录因子，于细胞周期循环中主要对G1/S以及G2/M转换相关重要基因起到转录调控作用，其功能和细胞增殖密切相关，且涉及有丝分裂、凋亡、染色体分离以及DNA损伤修复等多个环节，于肿瘤发生、发展过程中起着至关重要的作用。细胞周期的不同阶段中，FoxM1蛋白可在细胞质之间穿梭，且在进入细胞核后的转录调控依赖促有丝分裂信号刺激以及Raf/MEK/MAPK通路活化[16-18]。Cdc25B在细胞核内的滞留会对有丝分裂的顺利完成发挥至关重要的作用，而离开细胞核的Cdc25B不仅远离自己的作用底物，甚至会多种蛋白相结合，继而无法有效识别靶蛋白，进一步导致了G2期阻滞，促使细胞周期发生停滞，进一步引起损伤修复机制的启动，介导肿瘤的发生、发展过程[19-20]。本研究发现，宫颈鳞癌组织中miR-590-3P以及FoxM1及Cdc25B蛋白表达明显升高。提示在临床实际工作中可能通过联合检测上述三项指标表达情况，继而实现对宫颈鳞癌的辅助诊断。与此同时，本研究经ROC曲线分析发现：miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白联合检测诊断CIN2+的效能较佳。考虑原因可能是上述基因、蛋白在宫颈CIN以及宫颈鳞癌中表达兼具共性和差异。此外，miR-590-3P可能通过调控PI3K-AKT信号通路，继而影响下游靶基因的表达，进一步参与了宫颈癌的发生发展过程。Cdc25B于细胞周期中扮演着G2/M转换关键基因的角色，其在一定程度上受FoxM1转录活化，已有相关研究报道显示[21-22]，Cdc25B基因水平会由于过表达HPV E2而被抑制或由于过表达HVP E7而出现升高，且高危型HPV会被募集至Cdc25B基因启动子区域。本研究发现，miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B细胞核内蛋白水平与高危型HPV感染密切相关，值得临床重点关注。经Logistic回归分析发现：高危型HPV感染的独立危险因素涵盖年龄、性伴侣人数以及生殖道炎症。考虑原因，可能是年轻患者的激素水平相对稳定，且免疫功能较强，对高危型HPV的防御能力较强；而性伴侣人数越多的患者可能出现重复性感染；生殖道炎症的发生可能对宫颈上皮造成损伤，从而降低了阴道局部免疫力，导致高危型HPV感染的概率升高。

综上所述，宫颈鳞癌组织中miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B细胞核内蛋白水平与高危型HPV感染明显相关，有望成为早期诊断CIN2+的潜在生物学指标，且联合检测上述各项指标有助于提高对宫颈鳞癌的早期诊断效能。