先天性白内障晶状体蛋白致病基因及其功能研究进展△

王珏雪 万修华

先天性白内障(CC)是指出生前后或出生后1年内发生的白内障,是造成儿童失明和弱视的重要原因。有研究显示,CC的总体患病率为0.63/10 000～9.74/10 000,地区亚组之间亚洲的患病率最高,为7.43/10 000[1-2]。目前针对CC仍以手术治疗为主,但手术治疗不可避免地会带来各种术后并发症,如后囊混浊、青光眼等,往往会终生影响患儿视力[3]。CC的病因复杂,可分为遗传性CC、非遗传性CC和特发性CC,其中遗传性CC约占22.3%[2]。CC的遗传方式主要包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X-性连锁遗传,其中以常染色体显性遗传最多见,占44.0%[4]。目前已知超过52个基因突变可导致非综合征型遗传性CC,包括晶状体蛋白基因、膜蛋白基因、细胞骨架蛋白基因、编码转录因子基因、水通道蛋白基因等[4-5]。CC具有很大的遗传和表型异质性,发病机制复杂[5]。对于基因功能的研究有助于揭露其发病机制,丰富其致病基因谱,因此,本文就其中晶状体蛋白致病基因及其功能研究进行综述。

1 晶状体蛋白基因

目前,在已经鉴定出的CC突变基因中,大约50.0%的突变发生在晶状体蛋白基因中[6]。晶状体蛋白是眼晶状体纤维细胞的主要组成蛋白,占晶状体中蛋白质含量的90.0%,包括α-晶状体蛋白、β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白,对维持晶状体的透明度和折射率起着至关重要的作用[7]。在不同的应力条件下,随着年龄的增长,β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白开始展开并部分聚集。蛋白质在晶状体中的聚集会增强光的散射,导致患者视力问题,即白内障。作为分子伴侣的α-晶状体蛋白与其底物β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白形成复合物可以防止这种聚集。晶状体中的各种蛋白质相互作用保持了晶状体的透明性[8]。

2 α-晶状体蛋白基因

α-晶状体蛋白属于小热休克蛋白家族,具有分子伴侣特性,由2个亚基组成,包括αA和αB,在人体中的比例为31[7],它们由位于不同染色体上的2个基因CRYAA(21q22)和CRYAB(11q22)编码,αA-晶状体蛋白主要存在于晶状体中,而αB-晶状体蛋白则广泛表达于多种组织器官,包括晶状体、大脑、肾、肌肉等[9]。晶状体蛋白聚集或聚合成高分子量复合物是白内障晶状体混浊产生光散射导致患者视力丧失的主要原因[10]。而α-晶状体蛋白不依赖 三磷酸腺苷(ATP)也可有效地与受损或部分未折叠的蛋白质结合,抑制蛋白质的错误折叠和广泛聚集[10]。

2.1 CRYAA基因突变

Litt等[11]首次报道了常染色体显性遗传的CRYAA基因突变R116C,突变使精氨酸编码为半胱氨酸,携带的正电荷减少,巯基增加,破坏了αA-蛋白多肽结构,损坏分子伴侣功能,从而导致聚合物的疏水性和蛋白质沉淀。Devi等[12]研究显示,R54C突变与常染色体显性遗传的先天性核性白内障具有相关性,并伴有小角膜临床特征表现。Khan等[13]报道的R54C突变引起常染色体隐性遗传性白内障,其中突变纯合子的家庭成员患有先天性全白内障伴小角膜,并且在突变的杂合子携带者中观察到双侧点状白内障,这与Devi等[12]的发现相反。针对热点突变位54位Arg残基的不同突变,Khoshaman等[14]研究发现,R54L、R54C及R54P突变蛋白在化学或热应激下均有淀粉样蛋白形成倾向,其中R54L突变蛋白显示出异常差的伴侣蛋白活性。此外,αA-晶状体蛋白中F71、R12C、R21L、R21W、R116C、R116H和G98R突变蛋白均表现出伴侣活性的损害[15-17]。Ahsan等[18]通过对R54C位点突变的深入研究发现,此突变不会影响晶状体蛋白的伴侣活性,而是导致核小体的组蛋白浓度增加,影响细胞转录活性,引发应激样反应,从而导致αB-晶状体蛋白易位至细胞核、细胞骨架元件的解聚和最终的细胞死亡等事件。此外,对于其他突变的功能性研究发现,小鼠中CRYAA的突变可以改变晶状体的代谢状态,使乳酸代谢增加,碳水化合物代谢减少[19]。这种生理状态的改变影响晶状体周围的渗透压及生物代谢状态从而促进白内障的形成[19]。Li等[20]进一步研究了基因调控通路的改变,结果发现,CRYAA中3个氨基酸残基的缺失诱导未折叠蛋白反应相关基因的表达,这些蛋白的高表达诱导晶状体上皮细胞凋亡,这可能是促进白内障形成的一个机制。因此,针对未折叠蛋白通路的靶向药物研究有一定的临床应用前景。

2.2 CRYAB基因突变

与CRYAA部分突变位点相似,CRYAB某些突变位点也显示出晶状体蛋白分子伴侣特性的损害。Bova等[21]通过体外实验证明,首个被报道的αB-晶状体蛋白突变基因R120G破坏了蛋白β-折叠结构的形成,影响分子伴侣特性,导致其与结蛋白的聚集,这可能是白内障形成的潜在机制。此外,影响分子伴侣特性的突变基因还有D140N[22]和D109A[23]。有趣的是,P20S 突变可以通过干扰αA-晶状体蛋白的伴侣活性参与白内障的形成[24]。Hayes等[25]的体外研究发现,αB-晶状体蛋白C末端的3个基因突变包括450delA、464delCT和Q151X,甚至增加了一些伴侣活性,但其破坏了αB-晶状体蛋白的稳定性,增加其自聚集的倾向,从而导致疾病发展。αB-晶状体蛋白在体内广泛表达,已被证实对肌动蛋白和微管蛋白有监护和稳定作用,还可以防止Bax和Bcl Xs易位到线粒体来保护线粒体完整性,此外,它还通过激活核因子κB(NF-κB)增强抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平,同时阻止caspase-3的成熟和活性,从而抑制细胞凋亡[26-28]。Raju等[29]研究D109H 和A171T突变发现了这2种基因突变中凋亡细胞显著增加,突变体 D109H 中活性 caspase-3 阳性的细胞增加,αB-晶状体蛋白的抗凋亡功能在这些突变体中受到损害。P20S 突变体中也发现了晶状体上皮细胞的凋亡水平显著增加[24]。其他可能的机制有P20R突变通过改变αB-晶状体蛋白的亲水性和等电点降低突变蛋白的溶解度而导致蛋白自聚集进而产生白内障[30]。R11、R56等突变位点的具体功能通路影响还有待进一步研究发现[18,31]。

3 β-晶状体蛋白基因

β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白均属于结构蛋白,统称为βγ-晶状体蛋白总科。β-晶状体蛋白根据等电点不同可以分为2类:酸性 β-晶状体蛋白(βA1、βA2、βA3、βA4)和碱性β-晶状体蛋白(βB1、βB2、βB3) 。酸性β-晶状体蛋白含有N端和C端延伸,而碱性蛋白仅含有N端延伸。所有的β-晶状体蛋白均有2个结构域,每个结构域中均有4个“Greek key”基序,这种特殊的结构有助于维持蛋白质的稳定性[7]。βA1-晶状体蛋白和βA3-晶状体蛋白由同一基因CRYBA3/A1编码,CRYBA2、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2和CRYBB3基因分别编码βA2-晶状体蛋白、βA4-晶状体蛋白、βB1-晶状体蛋白、βB2-晶状体蛋白和βB3-晶状体蛋白。

3.1 CRYBA3/A1基因突变

目前发现的CRYBA3/A1基因突变有IVS3+1 G>A、IVS3+1 G>C、IVS3+1 G>T、IVS3+2 T>G、c.30-2 A>G 5种剪接位点突变,其中c.30-2A>G 突变的可能机制是突变导致成熟 mRNA的异常剪接,产生稳定性差和功能失调的蛋白质[32]。Wang等[33]在中国家庭中新发现的ΔG91缺失突变发生在“Greek key”基序中,突变体可产生折叠缺陷并导致蛋白质溶解度降低,最终产生的临床表型为非进展性核性白内障。Xu等[34]对G91的缺失突变分子机制深入研究发现,βA3-晶状体蛋白在体内保持二聚体与单体平衡状态,G91缺失突变体疏水表面暴露增加,倾向于形成蛋白单体,突变体的热稳定性、空间稳定性和结构稳定性均降低,低温下易形成蛋白质聚集体,且聚集体可诱导早期凋亡细胞比率增加,促使细胞凋亡。有研究表明,羊毛甾醇在抑制晶状体蛋白聚集和减少白内障形成中起关键作用[35]。

3.2 CRYBA2基因突变

CRYBA2基因在晶状体上皮细胞和纤维细胞中表达,Reis等[36]最先发现了CRYBA2基因的错义突变c.148G>A(V50M),此突变产生致病作用的具体分子机制目前尚不清楚。βA2蛋白相关的突变还包括c.193G>A(G65A)[37]、c.343A>G(N115D)[38],但其具体分子作用机制还需进一步研究探索。

3.3 CRYBA4基因突变

迄今为止,在CRYBA4基因中已经报道了10个致病突变基因,包括F94S[39]、L69P[39]、G64W[40]、Y67N[41]、T84N[42]、S93P[43]、A9V[38]、G147V[44]和M14K[42]。CRYBA4基因最初的突变由Billingsley等[39]报道,表型为常染色体显性白内障且伴有先天性小眼球,突变c.317T→C(F94S)是疏水的极性氨基酸突变为非极性小氨基酸,降低了βA4-晶状体蛋白单体的稳定性;突变c.242T→C (L69P) 则可能是通过破坏β-折叠影响蛋白质结构稳定性从而致病。G147V突变位于“Greek key”基序IV,是第一个与常染色体隐性遗传相关的CRYBA4基因突变[44]。G64W、Y67N、T84N、S93P突变均位于“Greek key”基序II。Wang等[45]报道的c.169T>C(F57L)突变位于β折叠中,可能通过破坏氢键降低蛋白质二级结构稳定性。近期发现的M14K突变是首个被报道的位于“Greek key”基序I中的突变,疏水性非极性蛋氨酸突变为亲水性极性赖氨酸,相应区域的疏水性改变可能会通过影响蛋白质二级结构从而损害蛋白折叠,降低结构稳定性,可能与G64W存在相同的致病分子机制[42]。

3.4 CRYBB1基因突变

CRYBB1基因突变最初由美国医生Mackay等[46]报道,G220X-βB1突变体位于外显子6,突变致使“Greek key”基序IV显著缩短,降低了突变蛋白在细菌中的溶解度。目前已报道20余种CRYBB1基因中的突变体,包括常染色体显性遗传和隐性遗传,其中隐性遗传突变位于外显子1/2,显性遗传突变位于外显子3/4/6,绝大部分突变位于“Greek key”基序中[42,47-48]。Rao等[49]将Q227X突变体与野生型比较发现,突变在结构上使C末端延伸和“Greek key”基序IV的缺失,这降低了βB1-晶状体蛋白的热稳定性,还影响在热应激下αA-晶状体蛋白的分子伴侣功能,干扰其与βB1-晶状体蛋白间的相互作用。针对导致CC小角膜综合征的首个突变体X253R的分子机制研究表明,突变体在细胞中诱导βB1-晶状体聚集,异常的细胞内聚集体对细胞存活显现毒性作用,可诱导细胞死亡;另一方面,突变体导致C端延长,增加了蛋白的疏水性,降低了蛋白溶解度[50]。与先前研究相似的是,以上突变的细胞内聚集体可以被羊毛甾醇溶解[50]。

3.5 CRYBB2基因突变

βB2-晶状体蛋白是含量最丰富的β-晶状体蛋白,目前已发现30余种突变体,大多数CRYBB2突变存在于“Greek key”基序 III和IV中[42]。Zhao等[51]对W59C和W151C突变体的研究证实了这2种突变可以降低蛋白质稳定性,增强其对紫外线敏感性导致聚集并诱导细胞凋亡。同样地,羊毛甾醇可以有效地溶解蛋白质聚集体,是预防和治疗CC的潜在选择。此外,Li等[20]研究证明,CRYBB2基因突变诱导未折叠蛋白反应相关基因的表达,而之前的研究证明相关基因可以诱导晶状体上皮细胞凋亡。Chen等[52]对I21N突变的致病机制研究进一步证实了这一点,揭示了诱导细胞凋亡的分子通路,其研究还指出,与野生型相比,突变体更倾向于在细胞核周围积聚,这可能会阻止晶状体纤维细胞的去核过程,从而导致晶状体混浊。

3.6 CRYBB3基因突变

对于βB3-晶状体蛋白研究最少,发现的突变基因也最少,至今共发现9种突变,其中8种为错义突变,一种为剪接位点突变,绝大部分突变位于“Greek key”基序中[42,53]。目前没有针对CRYBB3基因突变的分子机制研究,根据对其他β-晶状体蛋白基因突变的研究可以推测,βB3-晶状体蛋白中“Greek key”基序的破坏对蛋白质特性的改变可能与其他β-晶状体蛋白基因突变有着相似的致病机制。另外,Yu等[42]报道的剪接位点突变c.75+1可以导致外显子的错误连接,影响成熟mRNA的剪接,是其致病的可能机制。

4 γ-晶状体蛋白基因

γ-晶状体蛋白家族包括γA-晶状体蛋白、γB-晶状体蛋白、γC-晶状体蛋白、γD-晶状体蛋白、γE-晶状体蛋白、γF-晶状体蛋白和γS-晶状体蛋白。先天性白内障突变主要见于CRYGC基因、CRYGD基因和CRYGS基因[6]。γ-晶状体蛋白主要分布在晶状体的核区域,具有2个结构域,每个结构域含有2个“Greek key”基序,结构分析表明,其所有非极性残基均堆积在内部,而极性残基则分布于表面,使分子在热力学和动力学上均更加稳定[54]。

4.1 CRYGC基因突变

目前已报道近30种CRYGC基因相关突变,几乎所有突变均位于“Greek key”基序II和IV中,CRYGC具有高度对称的内部结构,突变可能会破坏这种对称,造成分子内的交联和相互作用,导致蛋白质的不稳定和聚集[6,55]。Xi等[56]对γC-晶状体蛋白中的G129C突变研究指出,突变可能会改变结构域相互作用界面,从而改变2个结构域的几何配对形状,在温和的变性条件下,增加的结构域运动可能通过结构域交换促进非天然低聚物的形成,这种易于聚集的中间体逃避了αA-晶状体蛋白的分子伴侣功能,突变体还可以形成淀粉样蛋白原纤维,对细胞产生毒性作用,诱导细胞凋亡。Fu等[57]对于先前报道的突变体L45P和Y46D研究揭示,生理温度下2种突变体均形成明显的聚集体,损害γC-晶状体蛋白的热稳定性,不过这种聚集可以被αA-晶状体蛋白抑制;进一步研究证明,突变体L45P和Y46D损害了“Greek key”基序中β-折叠的氢键网络,改变了γC-晶状体蛋白的二级结构,使得突变体在紫外线照射、pH值变化、氧化应激和化学试剂等环境下具有低溶解度和高聚集倾向,是引起白内障的潜在分子机制[58]。

4.2 CRYGD基因突变

研究发现,人体的γD-晶状体蛋白中存在氧化还原酶活性,带有氧化还原酶活性的二硫化物可以转移到W42Q突变体N末端暴露的半胱氨酸残基上,使突变体锁定在易于聚集的中间状态,并且溶解度降低[59]。Aguayo-Ortiz等[60]对γD-晶状体蛋白的10种突变体研究发现,位于“Greek key”基序中的W42R突变是最不稳定的突变体。W42R突变体破坏了维持γD-晶状体蛋白折叠内在稳定性的疏水区域,使疏水残基暴露,非特异性疏水相互作用形成高浓度的二聚体和高级寡聚体,导致晶状体蛋白的大量聚集[61]。另外,对于P24T突变的研究指出,参与白内障形成的蛋白质聚集过程可能在性质上不同于先前研究的可以被羊毛甾醇逆转的淀粉样蛋白[62],这种蛋白质-蛋白质相互作用的变化远早于淀粉样蛋白形成之前,可能是预防或治疗方法研究的新思路。

4.3 CRYGS基因突变

目前,CRYGS已存在9种突变[63-64]。Vendra等[54]对γS-晶状体蛋白S39C突变体进行分析发现,丝氨酸被半胱氨酸取代,使蛋白表面极性变大,增加了疏水性,从而导致自聚集并产生光散射颗粒。而针对此位点的进一步研究发现,S39C突变并没有改变晶状体蛋白质的二级和三级结构,而是通过阻止γS-晶状体蛋白形成二硫键连接的二聚体,从而降低了蛋白质结构的稳定性[65]。Zhang等[64]在Y67N错义突变中不仅发现了突变体局部的疏水性降低,而且在细胞中的定位也发生变化,在细胞膜中显著增加,而在细胞质中略有减少,这种亲水性和定位的改变是其致病的潜在机制。G75位于连接“Greek key”基序I和II中2个β-晶状体蛋白折叠的环上,Zhu等[66]对G75V突变体进行蛋白质特性研究发现,该突变主要改变γS-晶状体蛋白的三级结构,致使其生物物理特性发生变化,降低了蛋白质的溶解度和稳定性,增加其在紫外线照射下的聚集倾向,诱导白内障发生。最新发现的错义突变F30S导致蛋白质芳香残基侧链周围的微环境变化产生增加对紫外线照射的敏感性,诱导聚集并降低蛋白质稳定性等效应[63]。He等[67]研究发现,ATP可以作为水溶剂来维持蛋白溶解度并防止晶状体蛋白的聚集,而维持眼晶状体ATP的正常浓度也是未来有希望的CC治疗策略。有研究发现,突变体G18V可以消除ATP对不稳定聚集的拮抗作用,促进疾病发生[68]。

5 结束语

CC病因复杂,其中遗传性因素是目前可研究的一个主要因素。本文针对其中晶状体蛋白基因的突变进展和功能分析进行总结,先天性白内障突变基因的主要致病机制为通过改变蛋白质的二级或三级结构干扰蛋白质的正确折叠从而影响蛋白质的溶解度和稳定性,形成细胞毒性的聚集小体,干扰蛋白质之间的相互作用并诱导细胞凋亡,消除ATP拮抗聚集效应等。目前对于治疗新思路的研究主要集中在药物逆转、维持ATP有效浓度及基因编辑技术等,实验主要采用体外模型或者动物模型,在人体中的应用问题还需要进一步研究解决。除了羊毛甾醇之外,白内障的潜在治疗药物还包括胭脂红虫、邻香兰素、萘醌色氨酸杂合物、芦丁、金纳米粒子等,这些药物均经研究证实可以在体外抑制晶状体蛋白的聚集,还需要更多试验探究其在人体中的药物转化作用。