二十二碳六烯酸对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

李 皓 陈悠然 王嘉君 吴蓉洲

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是各种因素导致冠状动脉处于急性、持续性的缺血缺氧状态所出现的心肌组织坏死[1]。随后引起心室容积增大及左心功能受损，两者不断相互促进与进展，影响远期预后，给患者的生命和生活质量带来严重影响[2～4]。因此探索心脏的保护机制，寻找早期且有效阻止心肌梗死后心脏重塑的发生、发展的干预方式，对改善AMI患者的生活质量及降低病死率有重要临床意义。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是富集于鱼肝油及海藻的多不饱和脂肪酸，为人体所必需，但人体无法自我合成，主要从外部摄取以补充人体所需[5]。

既往研究发现，在大脑中动脉栓塞之前，饮食中补充DHA可显著减少脑梗死面积，同时有研究证实，DHA能通过自噬改善缺血导致的肾功能障碍[6，7]。一般情况下，心脏中存在低水平的自噬，当发生缺氧、能量供应不足或病原体入侵等应激情况时，则自噬被过度激活[8,9]。因此推测DHA可以通过自噬改善大鼠因急性心肌梗死导致的心肌损伤。本研究通过左前降支冠脉结扎法构建大鼠急性心肌梗死模型，采用DHA预处理，引入自噬流阻滞剂氯喹(chloroquine, CQ)，探讨DHA在AMI中的作用及机制。

材料与方法

1.实验动物与主要实验试剂：无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雄性8周龄SD(sprague-dawley，SD)大鼠96只，体质量为180～200g，购自北京维通利华实验动物中心，饲养于温州医科大学实验动物中心恒温恒湿环境(温度为24±1℃，湿度为45%±10%)，用于制备AMI模型。实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2015-0009。DHA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。CQ购自美国Sigma-Aldrich公司。Dorsomorphin(Compound C)购自美国Selleck Chemicals公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗购自北京安必维抗体技术有限公司，微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3，LC3，#14600-1-AP)一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；SQSTM1/p62(Sequestosome 1，SQSTM1/p62，#23214)一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。

2.实验分组及造模：96只大鼠按照随机数字表法分为假手术组(sham组)、急性心肌梗死组(AMI组)、DHA预处理组(AMI+DHA组)和DHA预处理+CQ联合处理组(AMI+DHA+CQ组)，每组各24只。DHA术前40min腹腔注射，剂量为250mg/kg；CQ术前2h腹腔注射，剂量为50mg/kg。大鼠AMI模型的制备主要是采用2%的异氟烷气体进行麻醉，通过开胸后结扎大鼠心脏冠状动脉的左前降支分支，结扎后左心室前壁因缺血变灰白且心脏的搏动减弱则说明结扎成功。关闭胸腔后将大鼠置于恒温垫上，待复苏后即造模成功。

3.心功能指标：大鼠AMI造模4周后，采用Vevo 2100超声诊断仪进行大鼠心脏超声的检测。每组按随机数字表法取6只大鼠，通过配套软件测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。连续检测5个心动周期，取平均值。

4.心肌纤维化程度：大鼠AMI造模4周后，每组按随机数字表法取6只大鼠心脏光学相干断层成像(optical coherence tomography，OCT)包埋，制备心肌组织冷冻切片。通过Masson三色染色试剂盒染色，丽春红4min，ddH2O清洗残余染液；磷钼酸3min，ddH2O清洗残余染液；冰醋酸1min，ddH2O清洗残余染液后甩干；苯胺蓝30min，ddH2O清洗残余染液，甩干；二甲苯Ⅰ5min；二甲苯Ⅱ5min；中性树脂封片。光学显微镜下观察切片中心肌组织纤维化部分。通过比较切片完整度、代表性从各个心脏组织所有切片中筛选出5张切片，分别拍取5张对应区域的200倍视野图像进行统计，计算相应的心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)。

5.Western blot法检测：大鼠AMI造模24h后，每组随机取6只大鼠，取其心肌组织，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取适量蛋白样品进行电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h后进行一抗孵育，分别添加LC3(1∶1000)、p62(1∶1000)、GAPDH(1∶5000)4℃孵育过夜，及相应的二抗(1∶5000)37℃孵育2h，洗膜后显色、拍照并观察各蛋白条带灰度值，分别计算LC3-Ⅱ及p62蛋白相对表达量。

6.CK-MB检测：大鼠AMI造模3天后，每组按随机数字表法取6只大鼠，采用异氟烷麻醉，颈动脉处取血4ml并静置8h(4℃)，随后3000r/min离心处理15min取上清液即可得到血清。按照双抗体夹心酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒说明检测各组大鼠血清CK-MB的含量。

结 果

1.DHA预处理提高AMI大鼠生存率：大鼠AMI造模4周后，采用Kaplan-Meier法分析其生存率，结果显示，与AMI组比较，AMI+DHA组的生存率明显升高(P<0.05)；与AMI+DHA组比较，AMI+DHA+CQ组的生存率降低(P<0.05)。提示DHA预处理可以提高AMI大鼠的生存率，而自噬抑制剂联合干预后降低了DHA对大鼠的生存率的影响(图1)。

图1 Kaplan-Meier法分析各组大鼠生存率与sham组比较，*P<0.05；与AMI组比较，#P<0.05；与AMI+DHA组比较，△P<0.05

2.DHA预处理降低AMI大鼠血清CK-MB含量：大鼠AMI造模3天后，检测血清CK-MB含量，结果显示，与sham组比较，AMI组血清CK-MB含量明显升高(P<0.05)；与AMI组比较，AMI+DHA组CK-MB含量显著降低；AMI+DHA+CQ组较AMI+DHA组CK-MB含量回升(P<0.05)。提示DHA预处理可以减少AMI大鼠血清中心肌梗死标志物CK-MB的含量，而自噬流抑制剂联合干预后则削弱了DHA对CK-MB的降低作用(图2)。

图2 ELISA法检测各组大鼠血清中CK-MB的含量与sham组比较，*P<0.05；与AMI组比较，#P<0.05；与AMI+DHA组比较，△P<0.05

3.DHA预处理影响AMI大鼠自噬指标LC3-Ⅱ、p62表达水平：大鼠AMI造模24h后，检测蛋白LC3及p62含量，与sham组比较，AMI组自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著增加(P<0.05)，自噬降解指标p62蛋白水平降低(P<0.05)；在AMI+DHA组中，LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步增加(P<0.05)，p62蛋白水平进一步降低(P<0.05)；在AMI+DHA+CQ组中，LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步显著增加(P<0.05)，p62蛋白表达亦显著回升(P<0.05)。提示DHA预处理可以进一步激活自噬；联合使用CQ后，心肌自噬流被阻断(图3)。

4.DHA预处理改善AMI大鼠心功能指标：大鼠AMI造模4周后，采用心脏超声评估心功能，结果显示，与sham组比较，AMI组左心室前壁变薄，LVEF及LVFS明显下降(P<0.05)；与AMI组比较，AMI+DHA组LVEF及LVFS显著回升(P<0.05)，提示DHA预处理可改善AMI后心脏功能。与AMI+DHA组比较，AMI+DHA+CQ组LVEF及LVFS降低(P<0.05)。提示DHA预处理可改善AMI后心功能，而联合使用自噬流抑制剂CQ后，DHA保护心功能的作用被逆转(图4)。

图4 超声心动图检测各组大鼠心脏射血分数A.sham组；B.AMI组；C.AMI+DHA组；D.AMI+DHA+CQ组；E.各组大鼠心脏射血分数；F.各组大鼠心脏左心室短轴缩短率。与sham组比较，*P<0.05；与AMI组比较，#P<0.05；与AMI+DHA组比较，△P<0.05

5.DHA预处理改善AMI大鼠心肌纤维化程度：大鼠AMI造模4周后，采用Masson染色评估心肌梗死区及边缘区胶原纤维沉积，结果显示，sham组未见明显胶原纤维沉积；AMI组心肌梗死区域CVF明显增加(P<0.05)，与AMI组比较，AMI+DHA组心肌梗死边缘区CVF显著降低(P<0.05)，提示DHA预处理可改善大鼠AMI后的心肌纤维化程度。与AMI+DHA组比较，AMI+DHA+CQ组CVF增加(P<0.05)。提示DHA预处理可改善AMI后心肌纤维化程度，而联合CQ干预后，此现象被逆转。

讨 论

AMI是一种危重心血管疾病，常伴心力衰竭、心律失常等严重并发症。近年来，AMI的病死率总体呈上升态势，将成为全球人口致死的主要原因之一，且其在青年群体中发生率逐渐增高，远期预后差[10～12]。溶栓及经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)等治疗方法的发展，使得AMI的存活率有所提升，但早期缺氧致心肌细胞死亡致使恢复期心室结构重塑、心脏泵血功能受损，最终导致心力衰竭。以往对DHA的研究主要在大脑发育、视网膜成熟、脑部功能改善等方面。DHA是促进大脑的结构和功能的发育和完善所必需的，通过影响神经元细胞的生长和分化、细胞之间的信号传递等，从而在生理状态以及疾病进程中保护神经功能[13～16]。近年来研究显示，DHA在缺血性疾病，如大脑中动脉栓塞、脑缺血再灌注损伤及缺血性肾衰竭等能发挥保护作用，但其在AMI中的具体作用机制未见报道[17～19]。

图5 Masson染色检测各组大鼠心肌纤维化程度(×200)A.sham组；B.AMI组；C.AMI+DHA；D.AMI+DHA+CQ组；E.各组大鼠心肌胶原容积分数。与sham组比较，*P<0.05；与AMI组比较，#P<0.05；与AMI+DHA组比较，△P<0.05。心肌组织胶原容积分数CVF(%)=胶原面积/总面积×100%

本研究通过构建大鼠AMI模型，并给予DHA预处理，通过检测血清CK-MB含量、心超评估心脏功能及Masson染色评估心肌纤维化，证实大鼠AMI模型制备成功，且在大鼠AMI模型中DHA预处理可以降低血清CK-MB含量，提高大鼠AMI后心脏射血分数，改善心功能水平，降低心肌纤维化水平，发挥心脏保护效应。但DHA发挥心肌保护作用的具体分子机制尚需进一步研究明确。

自噬的适度激活可改善缺血、心律失常、心力衰竭等导致的心肌损害[19，20]。AMI过程中，心脏的供血突然中断，细胞处于饥饿状态，在缺血诱导的心肌损伤模型早期，适度的自噬能给心肌带来帮助[21，22]。自噬典型过程主要包括自噬前体形成、自噬小体形成、自噬小体与溶酶体融合过程，以及自噬溶酶体的降解[23]。LC3是自噬的关键蛋白，与Atg5-Atg12-Atg16连接系统一同参与自噬小体的形成，自噬小体形成时，胞质型LC3(LC3-I)会被切割掉一部分片段，形成膜型LC3(LC3-Ⅱ)[24～28]。SQSTM1/p62可与泛素相互作用，诱导蛋白酶体或溶酶体降解蛋白。自噬中，p62蛋白连接LC3和泛素化底物一同构成自噬小体，并且随着自噬的发展在自噬溶酶体中与“货物”一起降解，从而作为自噬降解的可靠指标[29]。

因此，本研究采用两种标志物以评估自噬流从生成至降解的过程，即自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ和自噬降解标记蛋白p62。本研究发现，AMI组LC3-Ⅱ蛋白表达增加，自噬降解指标p62蛋白水平降低，提示AMI时，心肌自噬被激活；DHA预处理后，LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步增加，p62蛋白水平进一步降低，提示DHA在促进自噬体生成的同时，对自噬-溶酶体降解也有作用，对自噬流的通畅可能存在一定程度的作用。在联合使用CQ后，阻断了DHA对自噬流的通畅，于此同时，DHA对心脏的保护作用也被逆转，心肌纤维化程度加剧，心脏射血分数降低，血清CK-MB含量回升。以上结果提示DHA在急性心肌梗死中的心肌保护作用可被自噬流抑制剂所阻断，表明DHA可以改善大鼠急性心肌梗死引起的心脏损伤；DHA通过激活心肌自噬而改善AMI引起的心脏损伤。

综上所述，DHA可通过调控心肌自噬改善大鼠AMI诱导的心肌损伤并改善其预后。以自噬为靶标研究AMI的诊断及治疗，值得临床重点关注。