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二十二碳六烯酸对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

2023-02-12陈悠然王嘉君吴蓉洲

医学研究杂志 2023年1期
关键词:造模预处理纤维化

李 皓 陈悠然 王嘉君 吴蓉洲

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是各种因素导致冠状动脉处于急性、持续性的缺血缺氧状态所出现的心肌组织坏死[1]。随后引起心室容积增大及左心功能受损,两者不断相互促进与进展,影响远期预后,给患者的生命和生活质量带来严重影响[2~4]。因此探索心脏的保护机制,寻找早期且有效阻止心肌梗死后心脏重塑的发生、发展的干预方式,对改善AMI患者的生活质量及降低病死率有重要临床意义。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是富集于鱼肝油及海藻的多不饱和脂肪酸,为人体所必需,但人体无法自我合成,主要从外部摄取以补充人体所需[5]。

既往研究发现,在大脑中动脉栓塞之前,饮食中补充DHA可显著减少脑梗死面积,同时有研究证实,DHA能通过自噬改善缺血导致的肾功能障碍[6,7]。一般情况下,心脏中存在低水平的自噬,当发生缺氧、能量供应不足或病原体入侵等应激情况时,则自噬被过度激活[8,9]。因此推测DHA可以通过自噬改善大鼠因急性心肌梗死导致的心肌损伤。本研究通过左前降支冠脉结扎法构建大鼠急性心肌梗死模型,采用DHA预处理,引入自噬流阻滞剂氯喹(chloroquine, CQ),探讨DHA在AMI中的作用及机制。

材料与方法

1.实验动物与主要实验试剂:无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雄性8周龄SD(sprague-dawley,SD)大鼠96只,体质量为180~200g,购自北京维通利华实验动物中心,饲养于温州医科大学实验动物中心恒温恒湿环境(温度为24±1℃,湿度为45%±10%),用于制备AMI模型。实验动物使用许可证号:SYXK(浙)2015-0009。DHA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。CQ购自美国Sigma-Aldrich公司。Dorsomorphin(Compound C)购自美国Selleck Chemicals公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗购自北京安必维抗体技术有限公司,微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3,LC3,#14600-1-AP)一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司;SQSTM1/p62(Sequestosome 1,SQSTM1/p62,#23214)一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。

2.实验分组及造模:96只大鼠按照随机数字表法分为假手术组(sham组)、急性心肌梗死组(AMI组)、DHA预处理组(AMI+DHA组)和DHA预处理+CQ联合处理组(AMI+DHA+CQ组),每组各24只。DHA术前40min腹腔注射,剂量为250mg/kg;CQ术前2h腹腔注射,剂量为50mg/kg。大鼠AMI模型的制备主要是采用2%的异氟烷气体进行麻醉,通过开胸后结扎大鼠心脏冠状动脉的左前降支分支,结扎后左心室前壁因缺血变灰白且心脏的搏动减弱则说明结扎成功。关闭胸腔后将大鼠置于恒温垫上,待复苏后即造模成功。

3.心功能指标:大鼠AMI造模4周后,采用Vevo 2100超声诊断仪进行大鼠心脏超声的检测。每组按随机数字表法取6只大鼠,通过配套软件测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)。连续检测5个心动周期,取平均值。

4.心肌纤维化程度:大鼠AMI造模4周后,每组按随机数字表法取6只大鼠心脏光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)包埋,制备心肌组织冷冻切片。通过Masson三色染色试剂盒染色,丽春红4min,ddH2O清洗残余染液;磷钼酸3min,ddH2O清洗残余染液;冰醋酸1min,ddH2O清洗残余染液后甩干;苯胺蓝30min,ddH2O清洗残余染液,甩干;二甲苯Ⅰ5min;二甲苯Ⅱ5min;中性树脂封片。光学显微镜下观察切片中心肌组织纤维化部分。通过比较切片完整度、代表性从各个心脏组织所有切片中筛选出5张切片,分别拍取5张对应区域的200倍视野图像进行统计,计算相应的心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)。

5.Western blot法检测:大鼠AMI造模24h后,每组随机取6只大鼠,取其心肌组织,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后,取适量蛋白样品进行电泳分离,转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h后进行一抗孵育,分别添加LC3(1∶1000)、p62(1∶1000)、GAPDH(1∶5000)4℃孵育过夜,及相应的二抗(1∶5000)37℃孵育2h,洗膜后显色、拍照并观察各蛋白条带灰度值,分别计算LC3-Ⅱ及p62蛋白相对表达量。

6.CK-MB检测:大鼠AMI造模3天后,每组按随机数字表法取6只大鼠,采用异氟烷麻醉,颈动脉处取血4ml并静置8h(4℃),随后3000r/min离心处理15min取上清液即可得到血清。按照双抗体夹心酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒说明检测各组大鼠血清CK-MB的含量。

结 果

1.DHA预处理提高AMI大鼠生存率:大鼠AMI造模4周后,采用Kaplan-Meier法分析其生存率,结果显示,与AMI组比较,AMI+DHA组的生存率明显升高(P<0.05);与AMI+DHA组比较,AMI+DHA+CQ组的生存率降低(P<0.05)。提示DHA预处理可以提高AMI大鼠的生存率,而自噬抑制剂联合干预后降低了DHA对大鼠的生存率的影响(图1)。

图1 Kaplan-Meier法分析各组大鼠生存率与sham组比较,*P<0.05;与AMI组比较,#P<0.05;与AMI+DHA组比较,△P<0.05

2.DHA预处理降低AMI大鼠血清CK-MB含量:大鼠AMI造模3天后,检测血清CK-MB含量,结果显示,与sham组比较,AMI组血清CK-MB含量明显升高(P<0.05);与AMI组比较,AMI+DHA组CK-MB含量显著降低;AMI+DHA+CQ组较AMI+DHA组CK-MB含量回升(P<0.05)。提示DHA预处理可以减少AMI大鼠血清中心肌梗死标志物CK-MB的含量,而自噬流抑制剂联合干预后则削弱了DHA对CK-MB的降低作用(图2)。

图2 ELISA法检测各组大鼠血清中CK-MB的含量与sham组比较,*P<0.05;与AMI组比较,#P<0.05;与AMI+DHA组比较,△P<0.05

3.DHA预处理影响AMI大鼠自噬指标LC3-Ⅱ、p62表达水平:大鼠AMI造模24h后,检测蛋白LC3及p62含量,与sham组比较,AMI组自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著增加(P<0.05),自噬降解指标p62蛋白水平降低(P<0.05);在AMI+DHA组中,LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步增加(P<0.05),p62蛋白水平进一步降低(P<0.05);在AMI+DHA+CQ组中,LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步显著增加(P<0.05),p62蛋白表达亦显著回升(P<0.05)。提示DHA预处理可以进一步激活自噬;联合使用CQ后,心肌自噬流被阻断(图3)。

4.DHA预处理改善AMI大鼠心功能指标:大鼠AMI造模4周后,采用心脏超声评估心功能,结果显示,与sham组比较,AMI组左心室前壁变薄,LVEF及LVFS明显下降(P<0.05);与AMI组比较,AMI+DHA组LVEF及LVFS显著回升(P<0.05),提示DHA预处理可改善AMI后心脏功能。与AMI+DHA组比较,AMI+DHA+CQ组LVEF及LVFS降低(P<0.05)。提示DHA预处理可改善AMI后心功能,而联合使用自噬流抑制剂CQ后,DHA保护心功能的作用被逆转(图4)。

图4 超声心动图检测各组大鼠心脏射血分数A.sham组;B.AMI组;C.AMI+DHA组;D.AMI+DHA+CQ组;E.各组大鼠心脏射血分数;F.各组大鼠心脏左心室短轴缩短率。与sham组比较,*P<0.05;与AMI组比较,#P<0.05;与AMI+DHA组比较,△P<0.05

5.DHA预处理改善AMI大鼠心肌纤维化程度:大鼠AMI造模4周后,采用Masson染色评估心肌梗死区及边缘区胶原纤维沉积,结果显示,sham组未见明显胶原纤维沉积;AMI组心肌梗死区域CVF明显增加(P<0.05),与AMI组比较,AMI+DHA组心肌梗死边缘区CVF显著降低(P<0.05),提示DHA预处理可改善大鼠AMI后的心肌纤维化程度。与AMI+DHA组比较,AMI+DHA+CQ组CVF增加(P<0.05)。提示DHA预处理可改善AMI后心肌纤维化程度,而联合CQ干预后,此现象被逆转。

讨 论

AMI是一种危重心血管疾病,常伴心力衰竭、心律失常等严重并发症。近年来,AMI的病死率总体呈上升态势,将成为全球人口致死的主要原因之一,且其在青年群体中发生率逐渐增高,远期预后差[10~12]。溶栓及经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)等治疗方法的发展,使得AMI的存活率有所提升,但早期缺氧致心肌细胞死亡致使恢复期心室结构重塑、心脏泵血功能受损,最终导致心力衰竭。以往对DHA的研究主要在大脑发育、视网膜成熟、脑部功能改善等方面。DHA是促进大脑的结构和功能的发育和完善所必需的,通过影响神经元细胞的生长和分化、细胞之间的信号传递等,从而在生理状态以及疾病进程中保护神经功能[13~16]。近年来研究显示,DHA在缺血性疾病,如大脑中动脉栓塞、脑缺血再灌注损伤及缺血性肾衰竭等能发挥保护作用,但其在AMI中的具体作用机制未见报道[17~19]。

图5 Masson染色检测各组大鼠心肌纤维化程度(×200)A.sham组;B.AMI组;C.AMI+DHA;D.AMI+DHA+CQ组;E.各组大鼠心肌胶原容积分数。与sham组比较,*P<0.05;与AMI组比较,#P<0.05;与AMI+DHA组比较,△P<0.05。心肌组织胶原容积分数CVF(%)=胶原面积/总面积×100%

本研究通过构建大鼠AMI模型,并给予DHA预处理,通过检测血清CK-MB含量、心超评估心脏功能及Masson染色评估心肌纤维化,证实大鼠AMI模型制备成功,且在大鼠AMI模型中DHA预处理可以降低血清CK-MB含量,提高大鼠AMI后心脏射血分数,改善心功能水平,降低心肌纤维化水平,发挥心脏保护效应。但DHA发挥心肌保护作用的具体分子机制尚需进一步研究明确。

自噬的适度激活可改善缺血、心律失常、心力衰竭等导致的心肌损害[19,20]。AMI过程中,心脏的供血突然中断,细胞处于饥饿状态,在缺血诱导的心肌损伤模型早期,适度的自噬能给心肌带来帮助[21,22]。自噬典型过程主要包括自噬前体形成、自噬小体形成、自噬小体与溶酶体融合过程,以及自噬溶酶体的降解[23]。LC3是自噬的关键蛋白,与Atg5-Atg12-Atg16连接系统一同参与自噬小体的形成,自噬小体形成时,胞质型LC3(LC3-I)会被切割掉一部分片段,形成膜型LC3(LC3-Ⅱ)[24~28]。SQSTM1/p62可与泛素相互作用,诱导蛋白酶体或溶酶体降解蛋白。自噬中,p62蛋白连接LC3和泛素化底物一同构成自噬小体,并且随着自噬的发展在自噬溶酶体中与“货物”一起降解,从而作为自噬降解的可靠指标[29]。

因此,本研究采用两种标志物以评估自噬流从生成至降解的过程,即自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ和自噬降解标记蛋白p62。本研究发现,AMI组LC3-Ⅱ蛋白表达增加,自噬降解指标p62蛋白水平降低,提示AMI时,心肌自噬被激活;DHA预处理后,LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步增加,p62蛋白水平进一步降低,提示DHA在促进自噬体生成的同时,对自噬-溶酶体降解也有作用,对自噬流的通畅可能存在一定程度的作用。在联合使用CQ后,阻断了DHA对自噬流的通畅,于此同时,DHA对心脏的保护作用也被逆转,心肌纤维化程度加剧,心脏射血分数降低,血清CK-MB含量回升。以上结果提示DHA在急性心肌梗死中的心肌保护作用可被自噬流抑制剂所阻断,表明DHA可以改善大鼠急性心肌梗死引起的心脏损伤;DHA通过激活心肌自噬而改善AMI引起的心脏损伤。

综上所述,DHA可通过调控心肌自噬改善大鼠AMI诱导的心肌损伤并改善其预后。以自噬为靶标研究AMI的诊断及治疗,值得临床重点关注。

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