超声波辅助解冻对南极磷虾品质及其后续冷藏特性的影响

钱韻芳，郁佳怡，汪敏晨，张 璩，王楚妍，朱国平，施文正，杨胜平,4,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306；4.农业农村部冷库及制冷设备质量监督检验测试中心，上海 201306）

南极磷虾（Euphausia superba）是当今世界资源量最大的单种生物之一，其总生物量估计达3.79亿 t[1-2]，是人类开发海洋这一“蓝色粮仓”优质蛋白新资源的宝库。随着近海渔业资源的衰退枯竭，南极磷虾被视为一种潜力巨大的渔业资源。但南极磷虾体内富含内源性自溶酶，死后易快速自溶[3]。随着南极磷虾资源开发利用的深入，冷冻南极磷虾原料在加工前所采取的解冻方式越来越受到关注，南极磷虾的解冻方式是影响其品质的重要因素之一。目前，有关南极磷虾解冻研究报道主要集中在国内。例如，曹荣等[4]研究了25 ℃静水解冻和自然空气解冻以及4 ℃低温空气解冻对南极磷虾加工品质的影响；迟海等[5]研究了15 ℃下自然解冻、静水解冻和微波解冻以及5 ℃低温解冻4 种不同解冻方式对南极磷虾品质的影响，结果表明15 ℃静水解冻更适合保证南极磷虾品质，但解冻过程是否对南极磷虾营养和质量造成损失等有待进一步研究，同时使用静水解冻时需对南极磷虾进行包装。

近年来，超声处理在食品中的应用也已成为研究热点。超声波是指频率高于2h 104Hz的机械波，在介质中传播时可产生热效应、机械效应以及空化作用。超声波在食品工业中的应用主要集中在乳化、杀菌、分离提取、雾化干燥、生物化学及促进冷冻冰晶核形成等领域[6]。有研究表明超声波辅助解冻作为一种新型高效解冻技术，在快速、高效解冻的同时，能够较好地保持食品品质[7]，但目前有关超声波辅助南极磷虾解冻的研究尚鲜见相关报道。为探究超声波处理对南极磷虾解冻的适用性和可行性，本实验通过分析南极磷虾解冻完成时及后续冷藏暂存过程中感官指标以及相关理化指标、微生物指标变化，研究超声波辅助解冻对南极磷虾品质的影响，以期为南极磷虾的生产加工利用提供理论依据，也为其他冷冻水产品的解冻提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾样品于2019年2月19日在南极48.2区（南纬60°22’和西经46°41’）捕捞并冷冻运至实验室，冻藏于－30 ℃冷冻保存箱。

铁琼脂培养基 青岛海博生物技术有限公司；轻质氧化镁、硼酸、盐酸、乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力检测试剂盒（A136-1-1）、胰蛋白酶活力检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

XEBJ-1000型超声波处理器 济宁谐成超声波设备有限公司；Testo875-1型红外热成像仪 德国Testo公司；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅仪器有限公司；VS-1300L-U型洁净工作台 苏州苏净集团有限公司；DHP-9162型恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；iMark酶标仪 美国Bio-Rad有限公司；Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；TA.XT.Plus型质构仪 英国SMS公司；MesoMR23-060H-I核磁共振成像分析仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

实验时将－30 ℃冻藏南极磷虾取出，迅速用洁净钢锯分割成10 cmh 10 cmh 5 cm虾块，随机分成4 组，每组随机取3 块样品。分组后采用不同包装方式和解冻条件进行解冻，A组：冻虾块用塑料网袋包装，置于15 ℃水浴，静水解冻；B组：冻虾块用塑料网袋包装，置于15 ℃水浴，超声波辅助解冻；C组：冻虾块用PE塑料袋包装，置于15 ℃水浴，静水解冻；D组：冻虾块用PE塑料袋包装，置于15 ℃水浴，超声波辅助解冻。

塑料网袋网眼孔径为2 mmh 2 mm，采用网袋包装与无包装静水解冻无明显差异，两种方式解冻的虾块均与介质水相接触，网袋的主要作用是便于后续实验快速收集解冻好的磷虾样品并滤水。超声波处理器设置为功率600 W、频率22 kHz。解冻完成后的南极磷虾挑选完整个体随机分装，每200 g用保鲜袋分装后立即放入4 ℃冷藏箱贮藏，冷藏过程中定期取样进行相关品质指标检测。

1.3.2 解冻完成时间测定

参考陈京美等[8]的方法，从冻虾块开始解冻计时，以虾块解冻至用手能轻松掰断，且断面处虾体完整即认为完成解冻，记录所用时间。

1.3.3 红外热成像分析

根据红外热成像仪说明书将红外热成像仪放置在解冻池中虾块正上方20 cm处，测量虾块的热场分布并拍照。

1.3.4 感官评价

参照曹荣等[4]的方法，根据表1所示标准，由6 名经感官评价培训的人员对解冻后的南极磷虾进行评分，以形态、色泽、黑变程度、肌肉组织品质和气味为评价指标，各项指标满分均为2 分，总分10 分表示样品品质最好。

表1 南极磷虾感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Antarctic krill

1.3.5 微生物分析

参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》及Qian Yunfang等[9]的方法测定南极磷虾中菌落总数和嗜冷菌数。

1.3.6 硬度测定

参照郭彤等[10]的方法测定南极磷虾硬度。

1.3.7 总挥发性盐基氮含量测定

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮仪法并略作修改测定总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量。准确称取5.00 g南极磷虾，用研钵研碎搅匀，用约10 mL蒸馏水冲洗进750 mL蒸馏管中，用自动凯氏定氮仪检测TVB-N含量。

1.3.8 多酚氧化酶活力测定

取0.1 g经冰浴研钵研碎的南极磷虾样品，加入1 mL试剂盒中的提取液，混匀后4 ℃下8000hg离心10 min，取上清液，置于冰上待测；参照试剂盒说明书方法，取150 μL样品于无菌EP管中，依次在EP管中加入600 μL试剂1和150 μL试剂2，于25 ℃水浴10 min后迅速放入沸水中加热10 min，冷却后5000hg常温离心10 min，收集上清液，酶标仪调节波长至410 nm，用蒸馏水调零后进行检测。按样品鲜质量计，以每分钟每克样品在每毫升反应体系中使410 nm波长处吸光度变化0.01定义为一个酶活力单位。PPO活力按式（1）计算。

式中：ΔA为吸光度变化值；V反总为反应体系总体积/mL；V样为加入反应体系中样品体积/mL；V提为加入反应体系中提取液体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.9 胰蛋白酶活力检测

参照试剂盒说明书方法，取0.2 g经冰浴磨碎的南极磷虾样品，加入1 mL样品均质液，混合均匀后4 ℃下12000hg离心10 min，取上清液于冰上待用。空白管和样品管中分别加入1.5 mL酶底物应用液，37 ℃温育5 min，空白管中加入0.015 mL匀浆液，样品管中加入0.015 mL待测提取液，加入样品的同时开始计时，混匀后，倒入直径0.5 cm的石英比色皿中，于253 nm波长处测定吸光度，记录30 s时的吸光度A1；重新将比色皿中的反应液倒入预先编号的原试管中，放入37 ℃水浴箱中准确水浴20 min，于20.5 min时记录吸光度A2。胰蛋白酶活力按样品鲜质量计，根据式（2）计算。

式中：V反总为反应体系总体积/mL；V样为取样体积/mL；V均为均质液体积/mL；m样为样品质量/g。

1.3.10 低场核磁共振弛豫时间及成像分析

参考于勇等[11]的方法设置参数进行低场核磁共振弛豫时间及成像分析。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 19.0软件通过Duncan’s法对实验数据进行差异显著性分析（P＜0.05），使用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾解冻红外热成像及解冻时间

南极磷虾从－30 ℃冷藏箱取出迅速切割包装后，分别进行15 ℃静水解冻及15 ℃水浴超声波辅助解冻，图1为解冻30 min后各组样品的红外热成像与对应实物图。网袋包装实物图颜色存在差异是由于所用网袋颜色不同，其材质网孔大小等均相同。红外热成像图主要用于实时监测虾块及水温变化，并对水温及时进行调控。从红外热成像图中也可见虾块解冻过程中温度场的分布情况，热量从冻虾块表面向内部传递，解冻过程也是由外及里逐步进行，样品附近水温基本控制在15 ℃左右。

图1 南极磷虾解冻30 min的红外热成像图和实物图Fig.1 Infrared thermographs of Antarctic krill thawed for 30 min with different thawing treatments

如表2所示，超声波辅助解冻的B、D组（65、75 min）南极磷虾解冻时间明显较静水解冻的A、C组（105、145 min）短，且采用塑料网袋包装的南极磷虾比PE塑料袋包装解冻更快。其中B组解冻耗时最短。网袋包装使传热介质水能够与冻虾直接接触，加快热传导速率，更易于解冻；且在15 ℃下水浴，超声波辅助能够加速南极磷虾解冻，从而缩短解冻时间，提高南极磷虾生产加工效率。这与超声波加速食品解冻的空化效应、机械效应、热效应和自由基效应等作用有关[12]。

表2 不同解冻方式解冻南极磷虾所用时间Table 2 Thawing time of Antarctic krill with different thawing treatments

2.2 不同方式解冻对南极磷虾感官评分的影响

解冻完成时南极磷虾的感官评分结果如表3所示。由于解冻过程中南极磷虾汁液渗出，塑料网袋包装组水浴的水质浑浊，而PE塑料袋包装组样品虽也有浑浊液体渗出并积留在包装袋中，但其包装袋外的水质依然清澈。受解冻时间、南极磷虾体内自溶酶和微生物的作用以及解冻过程渗出汁液浸泡等因素影响，C、D组虾外观品质较差，感官评分较低，固有气味较强。而塑料网袋包装南极磷虾解冻产生的汁液大多进入浸泡水中，因此虾个体外观较好，尤其超声波辅助解冻的B组感官得分较高，可见超声波辅助不仅可以加速南极磷虾解冻，还具一定的清洗作用，可以去除解冻后产生的乳白色组织液，同时还可能起到去除内源酶的作用，延缓黑变和抑制蛋白质降解等反应。

表3 不同方式解冻完成时南极磷虾的感官评分Table 3 Sensory evaluation of Antarctic krill after different thawing treatments

如图2所示，在后续冷藏过程中各组样品的感官评分均逐渐下降。塑料袋包装静水解冻的C组磷虾样品在冷藏第28小时虾身变柔软，大部分呈溶解状，保鲜袋内积累了乳白色虾汁液，其整体感官品质明显差于网袋包装的磷虾样品，而对比相同包装方式，超声波辅助解冻的D组磷虾样品虾体较为饱满，感官品质略好。塑料网袋包装组磷虾样品在冷藏第28小时的感官评分明显高于塑料袋包装组，这是由于采用塑料网袋包装的南极磷虾冻块在解冻过程中含有自溶酶的解冻汁液溶于水中，网袋中磷虾样品自溶酶含量较少，从而使冷藏期间磷虾蛋白降解相对缓慢[13]。

图2 经不同方式解冻后南极磷虾冷藏过程中的感官评分Fig.2 Sensory evaluation of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.3 不同方式解冻对南极磷虾冷藏期间微生物数量的影响

如图3所示，解冻前南极磷虾的初始菌落总数为1.94（lg（CFU/g）），远低于目前全球产量第一的凡纳滨对虾新鲜样品[14]，说明南极磷虾生长的低温环境使其携带的微生物数量较少，且捕捞后直接船上冻结并于低温下冻藏保存能够较好地抑制微生物的生长繁殖。解冻后0 h，A、B组菌落总数有所升高，而C、D组没有明显变化，这可能是由于网袋包装的磷虾在解冻时接触到水中存在的微生物，而PE塑料袋隔水解冻能够较好地阻隔磷虾与水，从而避免了水体中微生物的污染。但在冷藏28 h期间，所有样品的菌落总数始终变化不大，且均处在较低水平（低于2.5（lg（CFU/g））），这可能是由于南极磷虾自身所携带的大多为嗜冷微生物，这些微生物在4 ℃低温环境下较短时间内不能快速复苏并增殖。一般认为，菌落总数超过106CFU/g表明水产品发生腐败[15]，而本研究中微生物数量始终较低，说明微生物腐败不是解冻磷虾在冷藏过程中品质劣变的主要原因。

图3 不同方式解冻南极磷虾冷藏过程中菌落总数的变化Fig.3 Changes in total viable count of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

如图4所示，解冻后南极磷虾中嗜冷菌数从解冻前的1.16（lg（CFU/g））快速增长至1.67～1.78（lg（CFU/g）），而在冷藏期间嗜冷菌数增长缓慢。南极磷虾中的嗜冷菌主要来源于捕获前其所生活的自然水体[16]，这类微生物能够适应低温[17]，并且在解冻处理后能一定程度恢复生长活性[18]。冷藏28 h期间，各组嗜冷菌数均呈缓慢上升趋势，但与菌落总数一样始终维持在较低水平，其中超声辅助解冻B、D组嗜冷菌数分别略高于相同包装静水解冻A、C组，说明超声辅助解冻处理可能由于机械振动和空化效应[12]促进微生物在虾肉组织中的扩散，一定程度上为微生物的生长繁殖拓展了空间，更有利于微生物对营养物质的摄取。

图4 不同方式解冻南极磷虾冷藏过程中嗜冷菌数的变化Fig.4 Changes in total psychrophilic bacterial count of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.4 不同方式解冻对南极磷虾冷藏期间硬度的影响

由于磷虾个体小，去壳容易造成肌肉损伤，因此实验中选择大小一致的整虾进行测定。如图5所示，解冻后冷藏第0小时网袋包装超声波解冻组南极磷虾的硬度高于静水解冻组，这可能是超声解冻能较好地维持南极磷虾硬度，也有可能是因为静水解冻处理组在水中浸泡时间更长所致；而此时塑料袋包装的超声波解冻组与静水解冻组硬度差别不大，有可能是因为塑料袋包装对于超声波具有一定的阻挡作用，同时塑料袋对水具有阻隔作用，从而避免了水的浸泡。超声波对肌肉组织破坏与否与超声波功率有一定关系，超声波功率过大也会导致肌肉组织破碎，因此选择合适的超声功率十分重要[19]。冷藏中后期12～28 h，网袋包装或塑料袋包装的静水解冻组样品硬度普遍高于其对应的超声波解冻组，说明静水解冻磷虾样品的质构特性在冷藏过程中较超声波解冻磷虾样品保持效果好，有可能是因为超声波作用导致肌肉组织结构遭到破坏，使南极磷虾硬度下降。但南极磷虾解冻后整个冷藏期间各处理组间硬度差异并不明显，由此可见，硬度并不是评判南极磷虾解冻冷藏品质的适宜指标。

图5 不同方式解冻南极磷虾冷藏过程中硬度的变化Fig.5 Changes in hardness of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.5 不同方式解冻对南极磷虾冷藏期间TVB-N含量的影响

水产品在内源酶和微生物的作用下会产生小分子碱性氨氮类化合物，即TVB-N，其含量可作为水产品腐败的评价指标[20]。如图6所示，解冻前南极磷虾中TVB-N含量仅为10.70 mg/100 g，与解冻前相比，解冻完成后即第0小时A组的TVB-N含量与解冻前相比变化不大，但B、C、D组分别达到16.29、19.01 mg/100 g和18.93 mg/100 g。冷藏期间各组TVB-N含量均呈上升趋势，塑料袋包装组整体略高于塑料网袋包装组，其中D组样品在贮藏末期TVB-N含量较高，说明超声辅助解冻结合塑料袋包装的磷虾更容易分解形成小分子氨氮类化合物，这可能是由于D组南极磷虾采用具有阻隔性的PE塑料袋包装，解冻产生含有蛋白溶解酶的汁液积存在袋内造成蛋白质的分解，而微生物对分解后的蛋白质也能更好地进行利用。因此，内源酶和微生物共同作用导致了南极磷虾TVB-N含量升高。

图6 不同方式解冻南极磷虾冷藏过程中TVB-N含量的变化Fig.6 Changes in TVB-N value of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.6 不同方式解冻对南极磷虾冷藏期间PPO活力的影响

如图7所示，解冻前后南极磷虾中PPO活力无明显变化，但在冷藏过程中各组PPO活力均呈先上升后下降趋势，这与凡纳滨对虾在冷藏过程中PPO活力的变化规律[21]相似。尤其在冷藏后期，C组PPO活力明显高于其他3 组，且在冷藏24 h达到最大值，而A、B组PPO活力始终维持在较低水平。这可能是因为A、B组磷虾用网袋包装浸泡在水中解冻时，PPO酶原随解冻汁液流失到水中，一定程度上使可被激活的PPO酶原含量减少，而C组与D组采用具有一定阻隔性的PE塑料袋包装，PPO或酶原积留在袋内的解冻汁液中。但D组南极磷虾PPO活力却低于C组，这可能与超声波处理破坏了酶活性中心结构有关[22]，其具体原因有待进一步研究。

图7 不同方式解冻南极磷虾冷藏过程中PPO活力的变化Fig.7 Changes in PPO activity of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.7 不同方式解冻对南极磷虾冷藏期间胰蛋白酶活力的影响

南极磷虾具有较强的自溶特性和低温活性，其中胰蛋白酶是其主要的自溶酶之一[23-24]。如图8所示，解冻前南极磷虾胰蛋白酶活力较低，说明冻藏能够抑制胰蛋白酶活力，但不能使其完全灭活。解冻后冷藏期间磷虾中的胰蛋白酶活力呈先快速上升后下降的趋势，说明解冻后磷虾胰蛋白酶活力被迅速激发。其中A组胰蛋白酶活力在冷藏第6、12小时达到峰值，B组胰蛋白酶活力在解冻后快速上升，其后18 h内基本维持稳定，C组解冻后胰蛋白酶活力上升不明显，但在冷藏6～18 h内一直维持在较高水平，而D组在解冻后胰蛋白酶活力快速上升，并且在其后18 h内一直维持在20h 102U/g以上。结果表明，PE塑料袋包装隔水解冻磷虾样品的胰蛋白酶活力整体较高，而网袋包装样品在超声清洗作用下流失部分组织酶液，使酶活力有一定下降。在南极磷虾冷藏后期，胰蛋白酶活力迅速下降，这可能是因为在冷藏末期南极磷虾自溶接近完全，胰蛋白酶激活了胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原、弹性蛋白酶原等蛋白酶原[25]，这些蛋白酶进而分解胰蛋白酶，使胰蛋白酶活力快速下降。

图8 不同方式解冻南极磷虾冷藏过程中胰蛋白酶活力的变化Fig.8 Changes in trypsin activity of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.8 不同方式解冻对南极磷虾冷藏期间水分分布的影响

图9为不同解冻方式处理的磷虾冷藏前后低场核磁共振成像伪彩图，其中不同颜色表示样品中水分信号的强弱，颜色越红表示信号越强、水分含量越高，颜色越蓝则水分含量越低[26]。各组样品虾头处颜色相对偏红，说明水分含量较高，而虾尾处颜色偏蓝，水分含量较低。冷藏28 h后各组样品磷虾整体呈红黄色，其中A组虾头部红色区域较小，整体偏黄蓝色，B、D组样品红色区域比例相对较大，说明超声辅助解冻的样品在冷藏后水分流失较静水解冻少。

图9 不同方式解冻南极磷虾冷藏前后的低场核磁共振成像伪彩图Fig.9 Low field nuclear magnetic resonance pseudocolor images of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

采用低场核磁共振技术分析得到经不同方式解冻后南极磷虾在不同冷藏阶段的水分信号峰面积。如图10所示，磷虾样品中不易流动水占比最大，结合水和自由水相对占比较小。解冻后冷藏期间4 组样品的总水分信号峰面积逐渐降低，而自由水峰面积略有增加，其中A、C组变化程度略小于B、D组，这可能是超声波的空化效应导致不易流动水更容易向自由水转变。但与鸡肉相比[27]，超声处理对南极磷虾水分组成的影响并不明显。

图10 不同方式解冻南极磷虾冷藏期间水分信号峰面积的变化Fig.10 Changes in water content of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

3 结论

本研究发现不同解冻方式能够对南极磷虾贮藏品质稳定性产生影响，且解冻后冷藏南极磷虾的品质劣变主要与内源酶有关，而微生物作用相对较弱。从解冻速率方面看，超声波辅助解冻能够缩短解冻时间，提高生产效率。超声波辅助解冻还具有一定的清洗作用，通过降低网袋包装南极磷虾中PPO和胰蛋白酶活力，从而延缓磷虾黑变和蛋白质水解，使解冻后的南极磷虾冷藏时间延长，更有利于磷虾后续的生产加工。