细胞生物传感器在食品风味评价中的研究进展

郭程琳，樊玉霞，陈高乐，刘登勇，刘 源,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

随着国民生活水平的提高，消费者对食品品质的要求从单一的满足营养需求提升到兼顾食品风味。食品风味是食品品质的重要评价指标之一，也是区分不同食品的重要特点。人体通过味觉和嗅觉对食品风味进行评价，不是基于某种单一感觉，而是味觉、嗅觉和三叉神经综合作用的结果，常被消费者用作判断食品品质的指标[1]。

目前，基于味觉或嗅觉感知原理的食品风味评价常规方法主要包括人工感官和智能感官评价，仪器分析技术则主要用于分析食品中滋味及挥发性风味物质。人工感官评价是指经过专业培训的感官评价人员对食品风味特性进行评价分析，其作为风味评价最直接的方法，具有分析速度快、成本低的优点；但对感官评价人员专业性有要求，也会受个体主观性及其他因素（年龄、地域等）影响，人工感官评价方法的应用在一定程度上受到限制，感官特征的量化分析仍有待解决。常用的仪器分析方法如高效液相色谱、液相色谱-质谱联用、气相色谱、气相色谱-嗅闻计等能实现食品中多种目标风味成分的定量检测，但无法揭示物质的味觉、嗅觉信息，也不能实现味觉、浓度与强度的综合评价。智能感官评价是指包括电子鼻、电子舌和机器视觉系统在内的多种智能感官仪器，通过模拟嗅觉、味觉和视觉系统功能，基于多传感器获得目标风味物质特征信号，结合模式识别方法实现感官的评价。相对人工感官评价，智能感官评价减少了人员培训、避免了主观性等因素的影响，但该方法无法取代味觉系统（从舌头到大脑）对风味物质的综合信息进行响应，并且构建传感器的敏感材料对特殊离子的吸附催化作用极大程度地影响了其对目标物质的分析检测能力[2]。

基于生物传感器对食品风味进行评价已成为近年来国内外学者的研究热点之一[3-4]。基于酶催化氧化还原反应的酶传感器已逐步应用于味觉化合物检测，主要集中在鲜味和甜味分析方面[5-7]。以味觉组织、受体等[8-10]为敏感材料的生物传感器与酶传感器相比，敏感元件可从自然界中获得，使用寿命也相对较长。味蕾组织的开发及使用使生物传感器在风味分析中的应用更加多元[11-12]。随着微生物固定化技术的发展，微生物传感器也逐步应用于风味分析、安全监测中，如对乙醇进行灵敏测定，检测咖啡因、霉菌毒素等化合物[13]。细胞尤其是味觉细胞，被普遍认为是构建味觉生物传感器的生物功能元件。目前，基于不同细胞作为生物敏感元件已开发出多种类型的传感器，可用于食品风味物质的评价分析。因此，本文旨在简明阐述细胞生物传感器概况，综述基于不同味觉和嗅觉细胞的生物传感器在食品风味评价中的研究进展，并对未来的研究方向进行展望。

1 细胞生物传感器简介

细胞生物传感器采用固定或未固定的生物活细胞作为传感器的敏感元件识别目标分析物，通过换能器实现信号处理，获取目标分析物的特征信息，通常信号响应特征与目标分析物存在一定规律的关联性，从而实现有效评价[14]。细胞生物传感器系统一般由3 个主要元件组成，包括一级感受器，即敏感元件，及两个二级感受器，即换能器和信号处理系统。根据细胞类型可将细胞传感器分为两大类：一是微生物细胞传感器，以细菌、真菌、酵母和藻类作为敏感元件；二是动物细胞传感器，以高等真核细胞为敏感元件，如鱼类、大鼠、人体细胞等。随着细胞生物传感器的不断发展，其在环境监测、医学诊断、制药、食品分析等方面的应用也在不断突破[15]。本文重点关注细胞生物传感器在味觉及嗅觉评价中的研究进展。图1所示为典型的细胞生物传感器构建及其在不同风味物质分析中的应用。

图1 典型细胞生物传感器示意图及其应用Fig.1 Schematic diagram of typical cell-based biosensors and their application

2 细胞生物传感器在味觉物质检测中的研究进展

已有研究表明，除味觉细胞外，其他细胞也能实现风味物质的识别，因此基于细胞生物传感器对味觉物质的检测在过去几十年中得到迅速发展[19-21]。用于味觉物质检测的细胞生物传感器，根据敏感元件不同主要分为味觉细胞传感器、鼠精细胞传感器、肠内细胞传感器、心肌细胞传感器。

2.1 基于味觉细胞的生物传感器

味觉系统能够辨识甜、苦、酸、咸、鲜5 种基本味型，其原理是味觉受体与味型分子结合后，味觉细胞膜去极化，释放神经递质，所产生信号经神经系统转化后传入大脑而作出响应。因此，选择味觉细胞作为生物传感器敏感元件是表达味觉信号最有效的方法之一。根据超微结构特征、基因表达模式与细胞功能，味觉细胞可分为3 种类型，即I型细胞、II型细胞和III型细胞，其结构如图2所示[22]。甜味、苦味和鲜味均由II型味觉细胞感受[23-24]，其中味觉受体T1R2和T1R3结合形成甜味受体，T2Rs为苦味受体，T1R1和T1R3结合形成鲜味受体；III型细胞感知酸味刺激[25-26]；而咸味刺激（NaCl）的感知味觉细胞尚未确定[27]。

图2 味蕾结构示意图[22]Fig.2 Schematic diagram of taste bud structure[22]

味觉细胞是味觉生物传感器常用的生物传感元件，作为敏感元件的细胞源具有灵敏识别信号并准确传导的优势[5]。味觉细胞来源于味蕾，但原代味觉细胞的培养相对困难，对微环境要求较高，且体外生存繁殖能力较弱[28]。因此，可以使用味觉干细胞培养类器官，体外分化味觉细胞作为敏感元件，将完好的味觉细胞作为基本的味觉感知单元[29]，可以在体外最大限度地模拟真实的味觉和细胞内信号转导[30]，能更直接感受味觉物质的刺激，这是实现味觉细胞传感器构建的基础。但类器官的培养也具有一定难度，同时存在培养出的味觉细胞种类难以控制、类器官中味觉细胞比例小及存活时间短等问题，一定程度上限制了味觉细胞传感器的发展。

在传感器的搭建中，为记录神经元的细胞外电位，研究人员利用不同的二级感受器，如场效应晶体管（field effect transistor，FET）阵列、MEA、光寻址电位传感器（light addressable potential sensor，LAPS）、玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）等感受器[31]，来实现信号记录和放大。其中MEA和FET适用于长期检测，但它们的记录位点仅限于电极或栅极位点。

表1总结了近年来基于味觉细胞传感器在味觉物质评价中的应用。通过构建味觉细胞传感器对不同甜味、苦味、酸味物质进行评价，反映出味觉细胞传感器检测种类多元、灵敏度高等优势，但仍存在敏感元件获取困难、稳定性低、难以大量推广等缺陷。与将其用作味觉物质分析仪器相比，将细胞传感器开发成生物传感模型更为合理，可以使其在味觉系统的基础理论研究中具有更好的灵敏度和选择性[32-33]。

表1 基于味觉细胞的传感器研究及应用Table 1 Research and applications of sensors based on taste cells

2.2 基于鼠精细胞的生物传感器

研究发现人和小鼠基因组中包含成对的直系苦味受体基因，Xu Jiang等[40]研究也证实了苦味受体基因在小鼠睾丸组织中大量表达。苦味受体基因在整个进化过程中都得到了保留，能够识别多种苦味化学物质[41-43]。小鼠睾丸中存在大量游离生殖细胞，因此作为细胞传感器敏感元件的细胞源具有显著数量来源优势。田玉兰[44]利用鼠精细胞作为敏感材料，根据细胞阻抗传感原理制备的传感器可以对苦味物质进行特异性检测。该实验探究了不同细胞密度下精细胞阻抗传感器的灵敏度，确定最佳细胞密度为4h 106个/mL；通过苦味浓度测试确定苯硫脲和奎宁两种苦味物质的检测范围分别为10～200 μmol/L和62.5～1000 μmol/L，检出限分别为4 μmol/L和40 μmol/L；此外，还发现传感器阻抗值增量与苦味物质浓度呈一定线性相关性。该方法结合了鼠精细胞对苦味物质特异性响应和细胞阻抗传感器能够实时无侵入测量细胞生理生态变化的特点，为苦味物质检测提供了一种新的思路。Hu Liang等[18]利用细胞阻抗的原理构建基于小鼠精细胞的苦味生物传感器，研究4 种苦味化合物的细胞阻抗响应，同时探究该细胞传感器对其他基本味觉的检测可行性。结果表明，该细胞传感器只对苦味存在特异性，对其他味觉物质无信号响应，为混合味觉物质中的苦味特异性检测提供了一种新思路。Tian Yulan等[45]构建了一种基于精子细胞的新型生物传感器，该传感器以小鼠活精子细胞为主要敏感元件，采用细胞内钙离子荧光探针（Fluo4-AM）作为传感器，并结合流式细胞术，实现了苦味化合物的快速定量检测；同时采用主成分分析法对3 种苦味物质进行分类，实现了苦味的定性评价与分类。精子细胞传感器表现出方法简便、价格低廉、灵敏度高、特异性强、检测限低等特点。但目前精子细胞传感器多用于苦味检测，应用范围有限，并且若使用细胞阻抗原理检测，传感器对外界味觉刺激响应缓慢，限制了味觉化合物的快速识别。因此，开发新的检测方法提高传感速度是精子细胞传感器商业化应用的一个突破方向。

2.3 基于肠道细胞的生物传感器

近年来，越来越多的研究人员对肠道细胞中味觉受体的表达机理进行阐释，发现小鼠、大鼠和人体的肠道内部均有甜味、苦味、鲜味受体表达。苦味物质在人结肠中可以通过苦味受体T2Rs进行识别，其中包括T2R3、T2R4、T2R5、T2R10、T2R13、T2R38、T2R39、T2R40、T2R43、T2R44、T2R435、T2R46、T2R47、T2R49、T2R50和T2R60[46]。鲜味物质可以通过T1R1与T1R3异源二聚体进行识别[47-49]，甜味物质可以通过T1R2与T1R3异源二聚体进行识别[50-52]。基于肠道细胞表达味觉受体的特点，以其为敏感材料的传感器也开始受到关注。表2总结了近年来基于肠道细胞的传感器及其应用。已有研究报道，NCI-H716和STC-1细胞多被用作肠道细胞敏感元件，构建阻抗传感器，且多数结果表明两种细胞可实现苦味和甜味物质的选择性识别[53-55]，并可以进行定量检测[56]。Hui Guohua等[57]在碳丝网印刷电极上分别培养NCI-H716和STC-1细胞，构建两种细胞传感器，结果表明，NCI-H716细胞传感器可以区分13 种甜味剂混合物和7 种含蔗糖的促味剂混合物，对蔗糖的检测范围为0.71h 10－1～2h 10－1mol/L；STC-1细胞传感器可以检测7 种不同浓度的奎宁促味剂混合物，对奎宁的检测范围为2.6h 10－5～5h 10－5mol/L。此类型传感器通过培养特定肠道细胞作为敏感元件构建传感器，相对容易，并且因其响应速度快、灵敏度高、选择性强等特点而受到关注[58-60]。但目前的研究仅对部分甜味和苦味物质进行了评价，并且分析检测前必须对检测条件进行优化，如信号放大、特征提取等；此外，在检测时还需通过一些生物学方法验证信号是由味觉物质结合到选择性味觉G蛋白偶联受体介导引起，未来还需进一步深入研究识别机制，拓展其应用范围。

表2 基于肠内细胞的传感器及应用Table 2 Applications of sensors based on intestinal cells

2.4 基于心肌细胞的生物传感器

最新研究表明味觉受体不仅能在味觉系统中表达，也在大鼠心肌细胞中进行表达[61]。味觉受体的广泛表达为生物传感器的构建提供了多种可能性。Wei Xinwei等[62]首次以大鼠心肌细胞为敏感元件，以MEA为次要传感器，记录体外心肌细胞的电生理信号，开发了一种基于仿生体外细胞的苦味和鲜味检测系统。结果表明，心肌细胞附着于传感器表面，生长情况良好，它们形成的合胞体进行电位传导和机械跳动，表明表面涂层具有良好的生物相容性；通过对苦、甜、酸、咸、鲜不同味觉成分进行生物特异性验证，并采用主成分分析对不同味觉成分进行鉴别，实现了对两种苦味物（苯甲地那铵、地芬尼多）和鲜味化合物（谷氨酸钠）的特异性检测，其中苯甲地那铵的检测范围为1.0h 10－5～6.4h 10－4mol/L、检出限为3.46h 10－6mol/L，地芬尼多的检测范围为5.0h 10－6～3.2h 10－4mol/L、检出限为2.92h 10－6mol/L，谷氨酸钠的检测范围为1h 10－6～4h 10－3mol/L、检出限为1.6h 10－6mol/L。该研究基于心肌细胞和MEA构建的味觉细胞传感器是一种全新的味觉检测方法，在区分苦味和鲜味化合物方面表现出良好的特异性。需要指出的是，位于心肌中的大部分G蛋白偶联受体的准确作用机制尚不完全清楚，未来仍需探讨。体内G蛋白偶联受体的广泛存在为味觉生物传感器提供了丰富的替代传感元件，基于心肌细胞的传感器在味觉检测和药物研究方面都具有良好的应用前景。

3 细胞生物传感器在气味物质检测中的研究进展

嗅觉传感器技术可以模拟人类嗅觉器官，实现对气味物质的评价。近年来，基于嗅觉细胞生物传感器的研究得到了广泛关注，并普遍应用于生物医学、食品、药品、环境保护等诸多领域[63-65]。根据作为敏感元件的细胞来源不同，用于气味物质检测的细胞生物传感器主要划分为以下3 类：脊椎动物嗅觉细胞传感器、昆虫受体细胞传感器、异源细胞传感器。

3.1 基于脊椎动物嗅觉细胞的生物传感器

脊椎动物的嗅觉细胞能够以极高的灵敏度识别不同气味物质，已被越来越多的研究者认为是开发细胞传感器的潜在对象。在嗅觉上皮中嗅觉细胞的轴突形成嗅神经，其中的嗅觉神经元拥有数以千计的嗅觉受体，能感受不同类型气味的刺激。因此，基于脊椎动物嗅觉细胞的嗅觉传感器具有强特异性、高灵敏度和快速响应等特点，是嗅觉传感器的理想生物材料[66]。Liu Qingjun等[67]通过将嗅觉细胞固定在LAPS的表面上构建了生物电子鼻。利用醋酸、丁二酮进行刺激测试，结果表明LAPS检测到嗅觉上皮中受体细胞的细胞外电位发生变化，通过主成分分析也可对醋酸、丁二酮进行区分。此类系统具有作为检测醋酸、丁二酮等气味的嗅觉生物传感器神经元芯片的潜力。但通常嗅觉细胞直接固定在换能器表面，导致细胞随机分布，且细胞与换能器耦合不可控。这种明显的缺陷导致这类仿生嗅觉细胞的生物传感器的性能和应用受到各种限制，因此如何实现嗅觉细胞与传感器的可控、高效耦合也是提高嗅觉细胞传感器性能面临的挑战之一。Du Liping等[68]采用DNA定向位点特异性细胞固定化方法，为细胞随机分布问题提供了新的解决方案。该方法以大鼠嗅觉细胞为敏感元件，MEA芯片为传感器，细胞在质膜上与单链DNA共价连接，而互补的单链DNA则以确定的图案印在支持物表面，由此控制细胞固定在固体支持物表面，以形成理想的细胞模式。通过辛醛和乙醛刺激嗅觉细胞传感器，有效监测嗅觉细胞的膜电位变化，进而监测传感器的响应。此方法不仅可以实现嗅觉细胞与MEA的可控位点特异性偶联，固定化的嗅觉细胞可以在传感器表面形成理想的分布，并对特定的气味刺激（辛醛和乙醛）作出响应；还可以极大提高耦合效率，增强嗅觉细胞传感器的稳定性。基于此，未来也可以将不同碱基序列的ssDNA附着在不同的嗅觉细胞上，构建化学传感微细胞阵列。但此类嗅觉传感器所获得的信号响应是多个嗅觉受体电信号的叠加，可能会给后期数据分析带来一定困难。

3.2 基于昆虫受体细胞的生物传感器

科学家已从果蝇、蚊子、蛾、甲虫等多种昆虫物种中鉴定出100多种气味受体的功能特征[69-71]。这些昆虫气味受体可选择性地感知不同类型的气味物质，包括醇、醛、酮、酸、烃和芳香族化合物[72]。Mitsuno等[73]使用昆虫细胞（Sf21细胞系）作为气味传感器元件，通过钙成像将细胞响应转化为非侵入性、可视化的荧光强度，并采用该气味传感器对(E,Z)-10,12-十六碳烯醇、反-10,顺-12-十六碳二烯醛进行测定；结果表明，异源蛋白基因稳定整合到细胞系基因组中，细胞能稳定表达昆虫气味受体并选择性区分不同气味。钙成像技术可防止对细胞造成机械损伤，能够在约13 s内作出快速响应；该方法不仅克服了基于细胞的生物传感器（如使用爪蟾卵母细胞的气味传感器[74]）寿命短的问题，其响应检测性能可保持至少2 个月，还极大增强了稳定性。目前，虽然可以构建多个表达不同嗅觉受体的气味传感器细胞系，但将多个细胞系集成到气味传感器阵列的方法尚未开发出。基于此种设想，Termtanasombat等[75]为在同一表面将多种细胞系结合，使用细胞图案化技术创建了具有多气味传感器细胞系阵列模式的气味传感器（图3），其原理同样是利用Sf21细胞系作为气味传感器元件，通过荧光强度反映对目标气味的响应。使用图案化的聚二甲基硅氧烷膜模板和细胞固定试剂，成功创建了表达Or13a、Or56a、BmOR1和BmOR34 种细胞系的阵列图案。通过检测1-辛烯-3-醇、土臭素、(E,Z)-10,12-十六碳烯醇和反-10,顺-12-十六碳二烯醛气味物质，证明了传感器能够区分多个目标气味。基于此类昆虫受体的细胞传感器具有稳定性好、可用响应检测时间长、可以表达多个细胞系受体、能够辨别多种气味的优点，但仍存在与其他类型细胞传感器类似的共性问题，包括复杂耗时的前处理工作流程，最终受体表达效率低，温度、湿度等环境条件可能会影响传感器的性能，传感器的最终构建成本高等，从而限制了此类传感器的商业化应用。

图3 基于细胞的气味传感器阵列开发示意图[75]Fig.3 Schematic diagram of cell-based odor sensor array development[75]

3.3 基于异源细胞的生物传感器

近10 年，许多研究者对嗅觉受体蛋白在异源细胞系统中的表达进行了尝试[76]。将某些嗅觉受体与其他生物材料（如细胞）通过人工方式进行转导系统的结合，并利用物理、化学探测器或传导微系统进行信号的表达，从而达到嗅闻的目的。研究表明，几种受体蛋白可通过大肠杆菌细胞[77]、酵母细胞[78-79]和爪蟾卵母细胞[80]等系统进行表达。表3总结了部分异源细胞来源嗅觉传感器的研究进展。与其他类型的嗅觉传感器相比，异源细胞传感器可在细胞质膜上仅表达一种所需类型的嗅觉受体，且其具有更好的维持嗅觉受体天然结构的特异性。此外，异源细胞传感器允许标记的转接，有助于嗅觉受体的有效固定[77,81]。但研究也发现异源细胞生物传感器构建中的一些问题，如基于表达的嗅觉受体生产耗时、劳动密集且效率相对较低等。此外，该方法的产物会含有一些不相关的蛋白质，需要额外的纯化。在表达嗅觉受体蛋白的功能分析方面也存在许多困难，如何做好细胞的抗凋亡策略也是异源细胞生物传感器研究面临的一个重要问题[82]。

表3 基于异源细胞的嗅觉传感器研究进展Table 3 Recent research progress on olfactory sensors based on heterologous cells

4 结语

从近几十年基于细胞的生物传感器发展来看，对细胞传感器作用机理的研究为新型细胞传感器在食品风味评价中的应用提供了理论依据。细胞传感器在食品风味评价方面表现出巨大的优势以及可观的发展前景。然而细胞传感器完全应用于风味评价仍然面临极大的挑战。目前基于细胞生物传感器应用的瓶颈主要分为3 个方面：1）细胞对微环境要求较复杂，原代培养较为困难。为解决这一技术难题，研究者通过干细胞培养类器官，体外分化为所需细胞，但其培养过程相对复杂，培养出的细胞也存在表达信号弱等问题；此外，通过构建能够表达特定味觉受体的人工细胞系进行异源蛋白表达，但人工细胞系是否能完全替代天然细胞的传感系统却不得而知。2）细胞传感器虽已建成但是仍难以满足多样化分析，发掘能够多样化表达的细胞有助于多功能细胞传感器的研究。3）细胞存在凋亡等问题，细胞传感器保存时间不长，长期储存后性能稳定性降低。降低成本与细胞传感器保持长时间稳定表达往往不能兼得，如何在降低成本的同时延长保存时间，也是细胞传感器在食品评价中能否实际应用的决定性问题。因此，在未来研究中，推动细胞传感器在关键味觉、嗅觉活性化合物筛选中的应用是食品风味评价方法的重要方向之一；3D/4D细胞培养可为细胞生长提供稳定的环境，以期其在味蕾细胞培养中应用，为细胞传感器敏感元件选择提供保障；增强细胞与次级传感器之间的耦合是提高传感器稳定性的一个良好思路，采用新形式电极可以促进电极与细胞之间信号转导，例如碳纳米纤维电极，改进味觉细胞培养方法、促进细胞电极耦合均是提高细胞生物传感器性能的有效策略。在应用方面，开发便携、多功能的细胞传感器，实现对食品风味物质的分析以及各种气味、滋味物质的准确识别，将具有广阔的市场应用前景。细胞传感器可与智能终端结合，实时、有效地对风味信息进行采集。在此基础上与人工感官结合，进行相关分析并建立数据库，为味觉、嗅觉评价建立统一的感官评价方法或评价标准。总之，以味觉及嗅觉感知机制研究为基础，基于细胞生物传感器的食品风味评价将为智能感官技术的发展提供一定理论依据。细胞生物传感器的发展促进了味觉、嗅觉系统相关理论的研究，在食品风味评价领域具有重要意义，在未来食品风味研究中将取得更大突破。