不同贮藏条件及加工处理后大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇膳食风险评估

娄雨豪，曹冬梅,3,4,*，张东杰，崔 航，王冀菲，杨 建，邵 懿

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江 大庆 163319；3.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；4.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；5.北大荒现代农业产业技术省级培育协同创新中心，黑龙江 大庆 163319；6.国家食品安全风险评估中心标准二部，北京 100022）

大麦为禾本科植物，其用途广泛，可作饲料饲草，还可为啤酒、保健品等提供原料[1]。而大麦在生长及贮藏期间易被真菌所污染，使其品质下降，威胁食用人群的健康。真菌毒素是真菌在适宜条件下产生的次级代谢产物，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）作为真菌毒素中检出率最高的一种毒素，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为第3类致癌物[2]。当人体内蓄积大量DON时会导致厌食、呕吐、消化系统紊乱，甚至会引起出血等症状[3]。有研究表明，DON对人或动物均具有急性或潜在的慢性毒害作用[4]，且还会联合其他毒素发挥协同作用使毒性增加[5]。近年来研究还发现DON具有一定的遗传毒性，可由母体遗传给子代从而造成危害[6]。但在安全摄入限量范围[7]内，DON并不会对人类健康构成风险。目前，已有大量关于DON污染粮食方面的报道，如李瑞园等[8]对200 份杂粮类样品进行了检测，发现其中的玉米、大麦、小麦、燕麦均有DON检出，分别占样本总数的51%、40%、32%、25%；陆晶晶等[9]以随机抽样的方法抽取了5678 份全国各大城市流通的小麦样品，共有3335 份样品检测出DON残留，其中有261 份样品超过规定标准，平均含量为317 μg/kg。

在食品安全性分析方面，风险评估是指在某个特定的条件下，人体摄入风险源后对健康产生不良反应可能性的评估，整个过程一般包含危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险描述4 个环节。其中暴露评估是整个风险评估中最重要的环节，它能够反映在各种条件下，危害物的含量水平以及在摄入不同含量危害物后出现不良反应的各种可能性，而危害识别与危害特征描述可以参考其他各国及世界卫生组织下达的各项标准及现有成果，对于真菌毒素来说各国人群的耐受剂量及摄入后出现的反应没有明显区别，但因为地域差异导致人群具有不同的膳食习惯，故需要结合当地饮食结构获得相应膳食暴露量以进行风险评估。目前已有学者对真菌毒素进行了风险评估，如梁馨予等[10]对花生油中黄曲霉毒素进行了风险评估，发现其平均暴露量为7.76 ng/kg，暴露边界值为52，具有较高的健康风险。Muhammad等[11]对零售谷类食品及其衍生物中的真菌毒素进行调查，得出每年每10万 人中会有1.66 人因摄入含黄曲霉毒素的谷物而患肝癌。Tolosa等[12]采集了坎帕尼亚地区的84 个无麸质面食样本，以监测霉菌毒素的暴露情况，发现儿童和青少年年龄组的雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马毒素暴露量较高，但多数研究主要集中在主粮上，有关大麦在不同贮藏环境及加工处理后DON膳食摄入风险的研究还鲜见报道。

因此，本研究将以大麦在不同温度（5、15、25、35 ℃）和不同相对湿度（55%、65%、75%、85%）条件下贮藏360 d，采用酶联免疫吸附试验检测不同贮藏条件及3 种加工处理（蒸制、煮制、发酵）后各样本中DON含量，对其以点评估与概率评估的方法进行风险评估，为合理评价DON毒素在粮食贮藏中的健康风险提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘CK15’大麦由佳木斯农业科学院提供，采收后直接进行实验；小麦粉、谷阮粉为市售。

硝酸镁、亚硝酸钠、氯化钠、氯化钾 广东西陇科学试剂有限公司；酶联免疫试剂盒（呕吐毒素） 上海酶联生物有限公司。

1.2 仪器与设备

TL-48R型粉碎研磨仪 上海万柏生物科技有限公司；QL-901型旋涡混合器 海门其林贝尔仪器制造有限公司；H1850型离心机 湖南湘仪仪器有限公司；Infinite F50型酶标仪 山东博科再生医学有限公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱 上海森信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 贮藏条件设置

通过人工模拟贮藏环境湿度[13]，依次配制饱和硝酸镁溶液、饱和亚硝酸钠溶液、饱和氯化钠溶液、饱和氯化钾溶液，分别模拟相对湿度55%、65%、75%、85%环境。将300 g大麦样品分装在标记不同相对湿度的烧杯中，共16 份（每个相对湿度4 份），再将盛有大麦样品的烧杯装入带有不同饱和溶液的大烧杯中，而后将其放入不同温度（5、15、25、35 ℃）的恒温培养箱中贮藏，分别模拟冷库贮藏、低温粮库贮藏、常温粮库贮藏、南方高温粮库贮藏。在180、270、360 d进行取样用于后续DON毒素检测，取样时在容器上中下层多点取样以获得较为准确的毒素含量，取样完成后立即放入培养箱中，以免外界环境对样品进行干扰。

1.3.2 不同加工工艺对DON的去除

1.3.2.1 原料预处理

因大麦中谷蛋白分子质量较小且醇溶蛋白含量较低，在和面时无法形成稳定的网状结构，导致面团松散，单独以其进行面制品加工时难以成型[14]，故需要与小麦粉配比使用且添加适量的品质改良剂。将大麦研磨成粉，过100 目筛，以1∶3的质量比加入小麦粉，再加入面粉总质量10%的谷阮粉得到复配后的杂粮面粉，混匀备用。

1.3.2.2 蒸制加工处理

将杂粮粉与40 ℃温水按照质量体积比2∶1混合，添加1%（以体系质量计，下同）的酵母，进行和面。揉面5 min直至面团光滑、不黏手，而后将面团放入36 ℃的培养箱中醒发2.5 h，拿出分块，每个50 g，揉成圆形后在室温下进行2 次醒发（整个醒发过程20 min）。将水加热至沸腾，放入蒸屉中蒸制20 min[15]。以无碳酸钠面团为对照，加碱面团中碳酸钠添加量设置为0.5%和1.0%。

1.3.2.3 煮制加工处理

将杂粮粉与40 ℃温水按照2∶1的比例混合，和面5 min直至面团光滑、不粘手，静置熟化30 min后，用面条机将其逐步压延成厚1 mm、宽3 mm的面条[16]。称取500 mL纯水煮沸，分别加入碳酸钠，碳酸钠添加量为面团含量的0.20%、0.25%、0.30%、0.35%，待溶解后放入做好的杂粮面条50 g，煮制8 min。

1.3.2.4 啤酒酿造处理

啤酒酿造工艺：大麦→浸麦→发芽→除根→粉碎→糊化→糖化→过滤→煮浮→添加酒花→旋沉冷却→发酵→过滤

选取适量优质大麦进行浸麦，使其相对含水量达到45%～50%左右进行发芽，除根后放入培养箱中干燥。取出粉碎进行糊化，在糊化锅中加入适量的水加热至40 ℃，进行搅拌投入麦芽，升温至50 ℃保持20 min后升高至63 ℃继续糊化30 min，在75 ℃下过滤，煮沸得到麦芽汁，酒花分3 次添加依次在10、50、80 min时加入10%、60%、30%，然后经过旋沉、冷却至15 ℃，接种酵母后分别在14 ℃发酵4 d、8 ℃发酵4 d、4 ℃发酵7 d。最终经过过滤得到啤酒。

1.3.3 DON毒素含量测定

酶联免疫吸附检测试剂盒存放在低温冰箱中，检测时将其移入室温环境（20～25 ℃），平衡1 h以上。准确称取2 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL去离子水振荡5 min，室温下4000 r/min离心10 min，取上清液0.5 mL并加入0.5 mL试剂盒中的复溶液混匀后进行分析。取上述溶液50 μL于试剂盒各微孔中，每个样本做两孔平行，加入酶标记物、抗体工作液各50 μL在25 ℃下反应30 min。洗涤后加入50 μL底物液A、B，25 ℃避光反应15 min。最后加入50 μL终止液，使用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度，以标准液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为y＝－0.2979x＋0.984（R2＝0.9980），通过标准曲线方程计算相应毒素大小。

1.3.4 风险评估

1.3.4.1 点评估法评估

点评估是指在暴露评估环节中的每一个参数都使用特定数值的方法，一般采用平均值代表人群暴露量的平均水平，以大麦中DON含量、调查对象大麦每日消费量及体质量，计算个体摄入DON的暴露风险。我国居民膳食指南中推荐每日大麦摄入量为50～150 g，人均体质量为50～72 kg，将以此作为评估特值估算膳食摄入量。本实验将以联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合委员会暂定的DON每日最大耐受摄入量（DON≤0.001 mg/kgmb）[17]作为评估标准。

长期膳食摄入及慢性风险评估计算[18]分别如公式（1）、（2）所示。

式中：EDI为每日估计摄入量/（μg/kgmb）；m1为食物中所含DON含量/（μg/kgmb）；m2为居民每日大麦消费量/kg；mb为体质量/kg；RQ为慢性风险评价指数；PMTDI为每日最大耐受摄入量/（μg/kgmb）。

DON的膳食摄入风险水平可由RQ进行量化分析，若RQ≤1表示摄入风险在可接受水平范围内，不会对人体造成不良影响；反之亦然，且数值越大风险越高。

不同人群每日摄入大麦大份餐摄入量标准根据世界卫生组织要求（表1），短期膳食摄入量及急性风险评估计算公式[19]分别如式（3）、（4）所示。

表1 不同年龄人群摄入大麦大份餐摄入量及体质量Table 1 Daily intake of barley by people of different ages

式中：NESTI为国家估计短期摄入量/（μg/kgmb）；v为变异因子（本研究取3）；L P 为大麦大份餐消费量/kg；m为大麦单果质量/kg；HR为最高检出值/kg；ArfD为急性参考剂量/（μg/kgmb）；HQ为急性风险评价指数。

1.3.4.2 概率评估法评估

其原理是根据随机抽样通过大规模的重复取样，估算某件事件出现的概率[20]。采用Monte Carlo法，使用Crystal Ball软件包@RISK6.0软件计算居民通过大麦摄入途径所得到毒素含量的暴露量[21]。与点评估相比，能够有效克服局限性，使结果更加接近于现实。

1.4 数据处理与分析

数据表示为平均值±标准差。运用@RISK软件进行暴露量及暴露风险的计算；运用SPSS软件对数据进行T检验分析各样本之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏条件下大麦中DON含量变化

由表2可知，在整个贮藏阶段，DON含量整体呈现上升趋势，由最初的0.435 mg/kg最高升至0.647 mg/kg，比贮藏前的大麦中DON含量高了0.212 mg/kg。其中贮藏180 d时DON含量上升趋势较为缓慢，其DON含量为0.458～0.552 mg/kg，这是由于刚收获的大麦通常处于休眠状态，随着贮藏时间的延长，大麦本身会逐渐脱离休眠状态以抵御真菌毒素的进一步污染[22]。在贮藏270 d时DON含量上升幅度较大，DON含量为0.478～0.593 mg/kg。Mannaa等[23]发现链格孢属与镰刀菌属在收获前会附着在成熟的谷物上，而DON正是镰刀菌属的次级代谢产物，经过一段时间的贮藏后逐渐产生代谢产物导致毒素累积，DON含量上升。也有研究表明，毒素在某一阶段含量较高可能是由于这种毒素的产毒真菌在这一贮藏时间达到了优良生长期，代谢量增大[24]。而在贮藏360 d时DON含量为0.502～0.647 mg/kg，较贮藏270 d时上升趋势较慢，可能是由于贮藏环境已趋于稳定并且田间真菌逐渐过渡为贮藏真菌，优势菌属发生了更替，镰刀菌属相对丰度占比下降，已有研究发现粮食在贮藏过程中不同类型的微生物代谢产物之间会相互抑制[25]。

表2 不同贮藏条件下DON含量Table 2 Change in DON content of barley under different storage conditions mg/kg

2.2 不同加工工艺下DON含量分析结果

以天然污染的大麦与小麦粉为原料，探究各加工方式对DON的去除效果，并以此研究人群摄入DON的慢性与急性暴露风险。由表3可知，经过不同加工工艺处理后食品的DON含量都明显降低，其中蒸制工艺的去除效果较弱，DON含量下降了0.086～0.211 mg/kg，其原因可能是蒸制时面团所接触水分较少，且没有达到破坏DON结构的温度；DON去除效果较好的工艺为煮制，其充分利用了DON溶于水、在碱性条件下不稳定的特点[26]，DON一部分受热分解，另一部分溶于水中，从而转移了样本中的部分毒素，以此达到去除的效果，煮制处理下DON含量下降了0.441～0.615 mg/kg，随着碳酸钠添加量的增加毒素的去除效果也增强，而添加0.30%碳酸钠和0.35%碳酸钠去除效果并无显著差异（P＞0.05），表明高浓度的碱性溶液对DON的去除效果也是有限的，当达到一定限值后，降解效果将会降低；在啤酒酿造过程中DON含量先由0.915 mg/kg降低至0.534 mg/kg，随后升高至1.035 mg/kg，呈现先降低后上升的趋势，原因可能为在浸麦过程中部分毒素溶于水，且在发芽时生成了毒性较低的代谢产物DON-3-葡萄糖苷与乙酰基DON，从而导致整体毒素含量降低[27]；而在发酵过程中毒素大幅度增加已超过初始大麦中DON含量，这可能是由于之前制麦发芽过程中生成的DON-3-葡萄糖苷与乙酰基DON通过酶的作用进一步转化为DON[28]，并且经过长时间适宜环境的培养，导致整体DON含量增加。

表3 不同加工工艺下DON含量Table 3 Change in DON content of barley products during processing

2.3 膳食风险评估结果

2.3.1 点评估

2.3.1.1 基于贮藏实验中DON含量膳食风险评估

大麦经各条件贮藏后，分别以贮藏180、270、360 d大麦所检出的DON含量（表2）作为评估特值，代入式（1）、（2）中进行慢性膳食摄入风险评估。由表4可知，摄入贮藏前初始大麦中DON的EDI为0.00030～0.00130 mg/kg、RQ为0.30～1.31；摄入贮藏180 d大麦中DON的EDI为0.00031～0.00170 mg/kg，RQ为0.31～1.66；摄入贮藏270 d大麦中DON的EDI为0.00033～0.00180 mg/kg，RQ为0.33～1.78；摄入贮藏360 d大麦中DON的EDI为0.00035～0.00190 mg/kg，RQ为0.35～1.94。可见，经过360 d的贮藏后，摄入DON的暴露风险均有一定程度上的升高，RQ最高增加0.63。而由于人体对真菌毒素DON的耐受量较低，且DON在粮食作物中易被大量检出、污染程度较高，因此DON在中国摄入人群中存在一定的暴露风险。

表4 基于大麦贮藏实验中DON含量的慢性风险评估Table 4 Chronic intake risk assessment of DON from barley under different storage conditions

在贮藏360 d 后，根据大麦中DON 最高检出量（0.647 mg/kg）、大份餐摄入量、急性参考剂量，以及世界卫生组织数据库中规定DON的急性参考剂量（8 μg/kgmb[29]）和大麦单果质量（0.0346 g），代入式（3）、（4）中进行急性膳食摄入风险评估。由表5可知，4～6 岁儿童摄入DON的NESTI为0.0055 mg/kg，HQ为0.69；而孕期女性摄入DON的NESTI为0.0026 mg/kg，HQ为0.33；一般人群摄入DON的NESTI为0.0042 mg/kg；HQ为0.52。其上表明短期急性暴露量均超过每日最大耐受摄入量，但若不长期保持此类饮食习惯，则尚不存在急性暴露风险，儿童由于体质量较轻，耐受量较低其暴露风险高于孕期女性与一般人群，需额外关注。

表5 基于大麦贮藏实验中DON含量的急性风险评估Table 5 Acute intake risk assessment of DON from barley under different storage conditions

2.3.1.2 基于加工处理后DON含量膳食风险评估

由表6可知，人群摄入初始面团中DON的EDI为0.00060～0.00260 mg/kg、RQ为0.60～2.60，而经过蒸制后EDI降低为0.00046～0.00230 mg/kg，RQ最高降低了0.63；经过煮制后EDI降低为0.00018～0.00130 mg/kg，RQ最高降低了1.84。人群摄入大麦中DON的EDI为0.00064～0.00280 mg/kg，经过发芽制得麦芽后EDI降低为0.00037～0.00160 mg/kg，RQ降低了1.23；经过发酵工艺制成啤酒后EDI升高为0.00072～0.00310 mg/kg，RQ升高了0.19。可以发现不同的加工工艺均会改变其膳食摄入风险水平，其中蒸制、煮制及发芽均会降低DON的摄入风险，而由于在发酵制啤过程中毒素含量增加从而导致膳食摄入风险上升。

表6 基于加工处理后DON含量的慢性风险评估Table 6 Chronic intake risk assessment of DON from barley subjected to different processing treatments

由表7可知，4～6 岁儿童摄入初始面团及大麦中DON的NESTI分别为0.0074、0.0078 mg/kg，HQ分别为0.92、0.97，经过蒸制后NESTI降低为0.0056～0.0067 mg/kg、HQ最高降低了0.22，经过煮制后NESTI降低为0.0021～0.0036 mg/kg，HQ最高降低了0.65，经过发芽制得麦芽后NESTI为0.0045 mg/kg，HQ降低了0.4，而经过发酵制得啤酒后NESTI升高为0.0088 mg/kg，HQ提高了0.13，达到1.10，已超过安全限值，存在一定急性暴露风险；孕期女性摄入初始面团及大麦中DON的NESTI分别为0.0035、0.0037 mg/kg，HQ分别为0.44、0.46，经过蒸制后NESTI降低为0.0027～0.0032 mg/kg，HQ最高降低了0.11，经过煮制后NESTI降低为0.0010～0.0017 mg/kg，HQ最高降低了0.31，经过发芽制得麦芽后NESTI为0.0022 mg/kg，HQ降低了0.19，而经过发酵制得啤酒后NESTI升高为0.0042 mg/kg，HQ提高0.07；一般人群摄入初始面团及大麦中DON的NESTI分别为0.0056、0.0059 mg/kg，HQ分别为0.70、0.74，经过蒸制后NESTI降低为0.0042～0.0051 mg/kg，HQ最高降低了0.17，经过煮制后NESTI降低为0.0016～0.0028 mg/kg，HQ最高降低了0.50，经过发芽制得麦芽后NESTI为0.0035 mg/kg，HQ降低了0.31，而经过发酵制得啤酒后NESTI升高为0.0067 mg/kg，HQ提高0.10。当原料DON含量过高制成啤酒后容易引起急性中毒，需特别关注。经过上述工艺加工后，其暴露风险除发酵工艺外均有一定程度的下降，煮制工艺效果最好，其次为发芽制麦与蒸制工艺。

表7 基于加工处理后DON含量的急性风险评估Table 7 Acute intake risk assessment of DON from barley subjected to different processing treatments

2.3.2 概率评估

利用@RISK6软件对64 份大麦中的DON含量、11 份经加工处理后大麦中DON含量、不同人群摄入量及体质量进行分布拟合，从Chi-Squared、Anderson-Darling和Kolmogorov-Smirnov 3 种检验方法中选择最优的拟合分布作为模型数据[30]，拟合图像如图1所示。

图1 各参数的拟合比较Fig.1 Comparison of fitting of various parameters

表8汇总了整个膳食暴露评估过程中各参数的分布数值，使用@RISK6软件利用其模型参数对仅通过食用大麦途径摄入的DON含量进行人体健康风险评价，以此进行模拟运算，将每日摄入量作为输出项，模型进行10000 次迭代、100 次模拟，模拟过程中将使用Latin Hypercube抽样方法，在多个变量的概率分布之间随机抽取一个数值进行交叉运算，得出所有可能的结果，以此呈现出DON摄入风险的所有概率可能。常选取第95百分位数或第97.5百分位数来表示高消费人群的暴露情况[31]。

表8 暴露评估中各参数汇总Table 8 Summary of parameters in the exposure assessment

不同消费人群通过食用大麦长期每日摄入DON的平均量为0.00086 mg/kgmb，最高值为0.00240 mg/kgmb（图2），高摄入个体（P90、P95、P99）DON暴露量为0.00134～0.00183 mg/kgmb（表9）。所得暴露量均大于PMTDI（DON≤0.001 mg/kgmb），即大麦经贮藏后DON暴露量对于成人有32.7%的暴露风险。而复配的天然污染杂粮粉（P50）经加工处理后摄入DON的平均值由0.00142 mg/kgmb降低为0.00068 mg/kgmb；高消费个体（P90、P95、P99）DON暴露水平由0.00222～0.00287 mg/kgmb变为0.00156～0.00312 mg/kgmb，其最大值升高是因发酵处理后原料中毒素含量上升，继而导致总体风险提升。总体暴露风险也由76.8%降为27.2%，这也与之前点评估结果较为相似。

图2 通过食用大麦途径摄入DON的暴露分布Fig.2 Distribution of dietary exposure to DON through consumption of barley

表9 不同消费人群的DON暴露量Table 9 DON exposure for consumer groups of different ages

3 结论

本研究对不同贮藏条件及3 种加工方式处理（蒸制、煮制、发酵）下的大麦中的DON含量进行了检测，发现大麦经过360 d的贮藏后，所含DON含量明显上升，会对人体健康造成威胁，进一步探究不同人群摄入后的暴露量及风险值，通过点评估研究结果发现，经过贮藏后RQ最高增加0.63，而HQ为0.33～0.69，不存在急性暴露风险；经过加工处理后，RQ和HQ最高可降低1.84、0.64。通过蒙特卡洛概率评估分析发现，通过食用大麦而每日摄入DON的暴露量大于PMTDI，即大麦经贮藏后，DON暴露量对于摄入人群来说有32.7%的暴露风险；大麦经过蒸煮处理后能够有效降低摄入风险，而发酵工艺则会加大摄入风险。并且不同人群摄入同一物质后的膳食摄入风险也有所不同，其风险大小与摄入量成正比，与自身耐受度成反比，因此往往儿童膳食暴露量较高，存在较大的安全隐患。

对于贮藏大麦中DON风险评估来说，大麦中DON含量及摄入量是整个风险评估过程中最为重要的两个参数。在整个过程中存在的不确定性，主要包括样本检测时与摄入量统计时的误差，以及建立各参数拟合分布的误差，这些误差的产生无法避免，只能通过人为地利用大量数据及模拟次数来减少对最终结果的影响，例如采集更多、更为分散的样本点来检测其含量，扩大覆盖人群面积等。本实验所得到的结果仅为理论上通过食用贮藏后的大麦从而摄入DON的健康风险评价，并未通过社会调查来获取当地居民的膳食习惯。谷物类食品作为膳食结构中的主要组成部分，其消费量较高，食品安全问题意义重大，应认真执行国家制定的检出标准，根据DON的特性加强对原粮的质量控制及脱毒，杜绝高污染食品，从源头上降低人体摄入DON的暴露风险。