南美白对虾响应急冷与无水暴露双重胁迫的生理变化特征

刘 澂，吴嘉鑫,2，徐德峰,2,3,*，孙力军,2，秦小明,2，范秀萍,2

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；3.大连工业大学 精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

近年来随着消费者对鲜活水产需求的快速增加，保活流通技术成为研究热点[1-3]。目前鲜活水产品的保活流通以有水方式为主，但较低的装载密度及对水质清洁度的较高要求使得综合运输成本偏高。相比而言，基于生态冰温诱导休眠的微水或无水保活流通技术则极大降低了运输过程中鲜活水产品的应激反应，可显著增加装载密度，降低单位运输成本，并通过控制代谢强度来消减溶氧、二氧化碳、氨氮等环境因素对水产动物存活的不利影响[4-6]，因而无水保活运输相较于有水活体运输具有更广阔的市场发展前景。南美白对虾（Penaeus vannamei）是当今全球最重要的养殖经济虾类之一，其无水保活流通具有良好的经济和社会效益[7]。虽然近年来水产动物无水保活技术研究日渐增多，设备逐渐多样化[8-10]，但目前对虾无水保活流通作业缺乏低温预冷过程，通常是直接将养殖塘中的对虾捕捞后投放于用冰块预冷至12～15 ℃的低温水体中，短时间内使其强迫进入半休眠或休眠状态，之后短途运输至特定流通场所，低温环境下将休眠态对虾装入聚乙烯袋，充氧密封后存放在内置冰袋的航空运输泡沫箱内，经纸箱外包装后快速运至附近机场，利用航空运输的速度优势实现远距离的快速保活流通。但该作业流程存在初期低温急冷（acute cold exposure，AC）和中途无水空气暴露（waterless duration，WD）双重胁迫（AC＋WD），必然对对虾个体存活质量造成影响，使得目前南美白对虾无水保活流通过程中应激性伤残死亡率高达20%～30%[3,10-11]。因此，迫切需要探明无水保活流通过程中南美白对虾响应AC＋WD双重胁迫的生理生化机制，识别关键生化标志物和响应途径，从而靶向控制伤残死亡率和提升存活质量。

代谢是维持细胞存活的基本方式，其中物质和能量代谢平衡是细胞存活的关键，而糖代谢途径和关键酶活力直接决定了细胞能量水平和代谢中间产物的细胞毒性，最终决定细胞存活与否[12-14]。此外，环境胁迫会引起水产动物的应激反应，为维持正常的生理状态，水产动物会从神经内分泌、生理生化、免疫调节等层面协同调节以适应环境胁迫[4]。长时间低温无水保活流通对加州鲈鱼（Micropterus salmonids）[15]、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）[16]、缢蛏（Sinonovacula constricta）[17]细胞能量代谢的影响已有报道；且研究发现广温性鱼类暴露于低温水环境时可调节代谢酶活力并改变代谢途径，从而使其代谢和生理活动适应环境变化[18]。然而，目前尚不清楚无水保活流通过程中南美白对虾对AC＋WD双重胁迫的代谢应答响应规律。此外，肝胰腺作为对虾重要生理活动执行器官，在物质代谢、环境响应和免疫防护方面发挥重要作用。因此，结合血液和肌肉组织生化指标变化，系统分析肝胰腺在南美白对虾无水保活流通过程中的生化代谢和组织特征变化，有助于揭示南美白对虾响应AC＋WD双重胁迫的生理调节机制，为优化南美白对虾无水保活运输管理、提升存活质量提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10 kg南美白对虾（个体质量（17.23f 1.12）g、体长（7.56f 0.42）cm）购于广东省湛江市霞山区水产品批发市场，随机均分5 份装于20 L聚乙烯袋中，每袋装有10 L海水，水体充氧后在1 h内运回广东海洋大学食品科技学院保活流通实验室。之后迅速将对虾置于1 m3新鲜海水（水温（23f 1）℃、pH（7.69f 0.5））中，于实验室环境下适应性暂养12 h，增氧泵连续曝气，不投放饵料，中途清洁海水换水一次。然后随机挑选无机械性损伤、状态良好的对虾进行后续实验。

柠檬酸、葡萄糖、氯化钠、柠檬酸三钠、乙二胺四乙酸二钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醛、冰醋酸（均为分析纯） 广州化学试剂厂；琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）、乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、Na＋/K＋-ATPase活力检测试剂盒以及葡萄糖（glucose，Glu）、乳酸（lactic acid，LD）、糖原（glycogen，Gn）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、蛋白质含量检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Varioskan全自动酶标仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；5810R多功能台式离心机 艾本德（中国）有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅 金坛朗博仪器制造有限公司；LTI-700W低温恒温培养箱 上海爱朗仪器有限公司；7002超低温冰箱 美国热电公司；S20供氧机宁波塞尔电气公司；层析柜 上海博迅仪器股份有限公司；塑料周转箱 东莞市茶山中距塑胶卡板厂。

1.3 方法

1.3.1 对虾分组与胁迫处理

参照徐德峰等[19]的方法，预先准备3 个塑料周转箱（490 mmh 345 mmh 285 mm）并连续编号，每箱分别注入20 L新鲜海水，将暂养后挑选的360 尾南美白对虾随机分为3 组，每组120 尾。将放入1号箱（24 ℃）中的对虾作为正常对照（normal control，NC）组。2号和3号箱使用全自动循环冷水机将水温降至对虾生态冰温休眠温度（12f 1）℃，将其余两组对虾分别放入2号和3号箱中进行AC处理诱导休眠，2号箱对虾在休眠30 min后取出，作为单独急冷胁迫组（AC组）。观察3号箱中对虾活动状态，至侧倒、游泳足摆动无规律、机械刺激无反应后捞出，模拟南美白对虾无水保活低温流通环境[20]，分装于塑料自封袋中（每袋10 尾），鉴于无水环境下机体易发生组织缺氧，故充入纯度99.5%的氧气后密封，然后置于12 ℃层析柜保存，作为AC＋WD双重胁迫组，取第3、6、9小时，以及9 h后放入自然水温（25 ℃）复苏2 h的对虾样品，分别记为AC＋WD3h、AC＋WD6h、AC＋WD9h、AC＋WD9h＋R组。以NC和AC组为对照，分别在不同时间点取血淋巴、肝胰腺和肌肉组织，检测相关代谢生化指标，并进行肝胰腺组织病理分析。

1.3.2 血淋巴、肝胰腺、肌肉组织样品制备及代谢指标测定

血淋巴的采集：参照彭迪等[20]的方法用1 mL无菌注射器，按照血与抗凝剂体积比1∶1的比例，从对虾腹血窦中采集血淋巴于1.5 mL离心管中，4 ℃、3000 r/min离心10 min取上清液，立即进行测定或于－80 ℃下冻存。按试剂盒说明书测定血清Glu、LD浓度和PK、PFK、HK、SDH、LDH活力。

肝胰腺组织匀浆液的制备：参照Jia Xuying等[21]的方法，在各时间点将对虾放于冰盘上迅速解剖取肝胰腺，质量分数0.85%的生理盐水冲洗后，冰上高速匀浆制备10%组织匀浆液，4 ℃、5000 r/min离心20 min后取上清液，立即进行测定或－80 ℃冻存。严格按照试剂盒操作说明检测肝胰腺中Gn、LD含量和HK、PK、PFK、SDH、LDH、Na＋/K＋-ATPase活力。除Gn含量外，各指标测定结果均以蛋白质量计。

肌肉组织匀浆液的制备：对虾剥壳后取第二腹节处肌肉0.5 g，冰上高速组织匀浆制备10%组织匀浆液，4 ℃、5000 r/min离心20 min后取上清液，立即进行测定或－80 ℃冻存。严格按照试剂盒操作说明检测肌肉Gn、ATP含量和Na＋/K＋-ATPase活力。Na＋/K＋-ATPase活力测定结果以蛋白质量计。

1.3.3 肝胰腺组织病理分析

按照本团队前期实验方法[22]，对各组对虾肝胰腺组织进行石蜡组织切片制备及结构观察。

1.4 数据处理与分析

实验各指标均平行测定3 次，结果采用平均值±标准偏差表示，采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析进行多重比较，采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾糖代谢的影响

以Glu为代表的糖类是生物能量的重要来源，而糖酵解途径则是所有生物细胞进行糖分解代谢的共有途径。AC＋WD双重胁迫后血清Glu浓度显著高于NC对照组（P＜0.05），随着双重胁迫时间的延长，Glu 浓度呈先升高后降低趋势，AC ＋WD 6 h 组最高，为（26.31 f1.05）mmol/L，复苏后Glu 浓度为（23.92f 0.59）mmol/L（图1A）。无氧条件下Glu糖酵解产生的丙酮酸会在LDH催化下产生LD。由图1B可知，血清、肝胰腺和肌肉组织中LD含量在冷胁迫后均高于NC组，双重胁迫下南美白对虾血清和肌肉中LD水平显著上升（P＜0.05）；9 h时血清、肝胰腺和肌肉组织中LD 水平分别为（7.90 f 0.11）mmol/L、（0.12f 0.03）mmol/g和（0.52f 0.02）mmol/g，明显高于其他各组，复苏后血清中LD 含量降至（6.27f 0.32）mmol/L，提示胁迫进程中南美白对虾组织缺氧逐渐加重。Gn是动物细胞内葡萄糖的储存形式，能够满足细胞应激时对能量的需求。由图1C可知，AC＋WD双重胁迫后南美白对虾肝胰腺和肌肉组织中Gn含量均连续下降，在9 h时肝胰腺和肌肉组织中Gn含量分别降至（4.48f 0.31）mg/g和（1.43f 0.14）mg/g，均显著低于NC组（P＜0.05），复苏后肌肉中Gn含量显著回升至（1.74f 0.10）mg/g（P＜0.05），提示双重胁迫下Gn分解代谢增强，可能源于应激条件下Gn生成Glu以维持机体能量供给稳定。Glu、LD和Gn水平变化表明AC＋WD双重胁迫破坏了南美白虾细胞糖代谢平衡。

图1 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾血清、肝胰腺和肌肉组织中Glu（A）、LD（B）和Gn（C）水平的影响Fig.1 Effects of combined stress of AC and WD on the concentrations of Glu (A),LD (B) and Gn (C) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.2 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾呼吸代谢途径的影响

SDH作为三羧酸循环中唯一镶嵌在线粒体内膜上的酶，连接氧化磷酸化和电子转移，其活性变化影响氧化磷酸化的进行，是有氧呼吸的标志酶[23-24]。由图2A可以看出，AC＋WD双重胁迫后AC＋WD3h组血清、肝胰腺和肌肉中SDH活力均较NC组有不同程度的增加，且胁迫3 h后分别为（2.36f 0.13）U/mL、（360.39f 15.48）U/g和（32.90f 0.89）U/g，明显高于其他组，表明双重胁迫组初期有氧呼吸较NC组增强，3 h后各组织中SDH活力逐渐下降，血清中SDH活力在9 h降至（1.61f 0.10）U/mL，复苏后回升且略高于NC 对照组，肝胰腺和肌肉中SDH活力在复苏后分别降至（277.24f 8.91）U/g和（25.00f 1.36）U/g，均低于NC组。SDH活力变化表明双重胁迫3 h后细胞开始由有氧代谢转为无氧代谢。

LDH是细胞内糖酵解和无氧呼吸的关键酶，能够促进丙酮酸向乳酸转化，常被用作反映细胞无氧代谢的重要指标[25]。由图2B可以看出，血清中LDH活力变化趋势与SDH活力类似，在双重胁迫3 h后LDH活力达到最高，为（53.06f 2.11）U/L，显著高于其他组（P＜0.05），而肝胰腺和肌肉中LDH活力在胁迫进程中呈持续上升趋势，且双重胁迫9 h时LDH活力分别增至（0.43f 0.02）×103U/g和（5.21 f 0.20）×103U/g，显著高于其他组（P＜0.05），复苏后LDH活力降至NC组水平，进一步表明南美白对虾无水保活过程中细胞由有氧呼吸逐渐转变为无氧呼吸，复苏后又转为有氧呼吸。

图2 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾血清、肝胰腺和肌肉组织SDH（A）和LDH（B）活力的影响Fig.2 Effects of combined stress of AC and WD on the activities of SDH (A) and LDH (B) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.3 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾糖酵解进程的影响

HK、PFK和PK为糖酵解途径的限速酶，其活力变化反映了糖酵解的速率，其中在糖酵解的第一个限速步骤中，HK将Glu转化为葡萄糖-6-磷酸。由图3A可以看出，HK活力在胁迫期间整体呈先升高后降低趋势，血清、肝胰腺和肌肉中HK活力均在3 h达到最高值，分别为（14.29f 1.21）U/mL、（2.14f 0.12）×103U/g和（0.52 f 0.07）×103U/g，显著高于其他组（P＜0.05），之后开始下降，且在9 h肝胰腺和肌肉中分别降至（1.52f 0.08）×103U/g和（0.39f 0.03）×103U/g，复苏后肝胰腺和肌肉中HK活力回升至NC组水平，表明糖酵解在前3 h较强，之后糖酵解速率下降。

PFK是一种变构酶，其催化效率较低，糖酵解速率严格依赖该酶的活力水平，且H＋浓度对该酶有抑制作用，因此乳酸积累可反馈抑制PFK活力，同时PFK活力也受高浓度ATP抑制[24-26]。由图3B可知，血清和肌肉中PFK活力在AC＋WD双重胁迫3 h时分别增至（101.54f 3.91）U/L和（86.50f 2.41）U/g，高于其他组，之后逐渐下降，9 h时分别降至（81.08f 7.22）U/L和（43.55f 3.10）U/g，复苏后回升至NC组水平；肝胰腺中PFK活力也呈类似变化趋势，说明糖酵解途径受到抑制。

PK在ATP合成过程中起决定作用，因此在细胞能量代谢过程中发挥重要作用[27]。由图3C可知，PK活力在胁迫进程中均呈先升高后降低趋势，但AC组血清和肝胰腺中PK活力最高，分别为（6.45f 0.32）U/L和（12374.04f 0.89）U/g，而肌肉中PK活力为AC＋WD3h组最高，之后各组织中PK活力逐渐下降，9 h时血清、肝胰腺和肌肉PK活力均达到最低点，复苏后均回升至接近NC组水平。HK、PFK和PK活力变化综合反映了AC＋WD双重胁迫对南美白对虾糖酵解进程产生显著影响，尤其是在胁迫后期显著抑制了糖酵解的进行。

图3 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾血清、肝胰腺和肌肉组织中HK（A）、PFK（B）和PK（C）活力的影响Fig.3 Effects of combined stress of AC and WD on the activities of HK (A),PFK (B) and PK (C) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.4 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾能量水平的影响

Na＋/K＋-ATPase亦称钠钾泵，通过消耗ATP维持细胞内外渗透压，同时可驱动细胞中糖和氨基酸的运送以调节细胞体积[7,12,27]。由图4A可知，AC胁迫后，肝胰腺和肌肉中Na＋/K＋-ATPase活力较NC组显著增加（P＜0.05），分别为（1629.28f 71.31）U/g和（1082.21f 62.89）U/g，而在AC＋WD胁迫进程中肝胰腺和肌肉Na＋/K＋-ATPase活力均呈下降趋势，AC ＋WD 9 h 组下降至（1111.80f 64.87）U/g和（750.19f 38.39）U/g，复苏后回升至接近NC组水平，可能是由于初期的急冷胁迫刺激Na＋/K＋-ATPase表达，而在AC＋WD的低温环境下酶活力明显受到抑制。此外，如图4B所示，肌肉中ATP含量在AC＋WD胁迫后较NC组逐渐下降，AC＋WD9h组降至最低（4.02f 0.21）μmol/g，显著低于其他组（P＜0.05），复苏后虽显著回升至（4.88f 0.31）μmol/g，但仍显著低于NC组（P＜0.05），提示胁迫进程中因细胞膜渗透性改变而内稳态失衡，为维持内环境平衡，细胞通过增加ATP消耗来加快细胞内物质输送，以维持细胞内的渗透压平衡。

图4 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾肝胰腺和肌肉组织中Na＋/K＋-ATPase活力（A）和肌肉ATP含量（B）的影响Fig.4 Effects of combined stress of AC and WD on Na+/K+-ATPase activity (A) and ATP content (B) in hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.5 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾肝胰腺组织病理结构的影响

甲壳动物的肝胰腺中含分泌细胞（B细胞）、吸收细胞（F细胞）、储存细胞（R细胞）和胚细胞（E细胞），成年商品对虾肝胰腺中以B细胞和R细胞为主，且环境应激会对细胞比例造成影响[28-29]。由图5可以看出，NC组对虾肝胰腺肝小管轮廓清晰，其中细胞形态正常且分布均匀，管腔形状规则，转运泡整体数量不多且在细胞内分布较为均匀；AC组管腔形态仍较为规则，但体积略有增大，基膜收缩，表明急冷胁迫对细胞组织有轻微损伤。AC＋WD胁迫3 h时空泡数量相较于NC组明显增加，B细胞数量减少，肝小管形状的空泡挤压性变形加重；AC＋WD胁迫6 h时空泡数量明显减少，但体积变大，且管腔体积进一步加大；AC＋WD胁迫9 h时大空泡数量增多，管腔被明显挤压变形，且管腔中细胞数量明显减少，破碎细胞组织数量增多，提示细胞发生了明显降解或凋亡。复苏组（AC＋WD9h＋R）中管腔仍有明显破损，但较AC＋WD6h和AC＋WD9h组明显减轻，空泡体积减小但数量明显增加，与AC＋WD3h组的组织形态特征类似，表明细胞损伤得到一定程度的修复。

图5 AC＋WD双重胁迫对南美白对虾肝胰腺病理结构的影响Fig.5 Effects of combined stress of AC and WD on the histopathology of the hepatopancreas tissue of Penaeus vannamei

3 结论

本实验通过模拟南美白对虾无水保活流通作业，探究12 ℃ AC＋WD双重胁迫对南美白对虾代谢和组织结构的影响，发现胁迫进程中伴随着SDH和LDH活力的变化，细胞呼吸由有氧呼吸转变为无氧呼吸，能量获取方式发生改变，同时糖酵解过程的限速酶HK、PFK和PK活力在AC＋WD双重胁迫3 h后整体下降，使能量发生明显亏损，进而导致血糖和乳酸积累，以及糖原含量持续下降，最终使细胞内代谢稳态失衡，为维持和恢复细胞代谢平衡，机体能量消耗增加，进一步使ATP含量持续下降，最终因能量亏损而诱导组织损伤。