帕博西尼联合他莫昔芬对乳腺癌细胞T-47D的作用研究*

孙 俊，廖 林，贾毅敏

(重庆大学附属肿瘤医院药学部 400030)

乳腺癌在我国发病率和病死率分别位于女性恶性肿瘤的第1位和第4位[1]，且近25年全球女性乳腺癌死亡率明显上升[2]。帕博西尼是高度选择性细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)和细胞周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)抑制剂，被批准用于激素受体阳性、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)阴性进展期乳腺癌的一线、二线治疗[3-4]，但帕博西尼单药使用效果不佳[5]，其联合内分泌疗法已经用于治疗晚期乳腺癌患者。他莫昔芬为雌激素受体拮抗剂，可与乳腺癌细胞表面的激素受体结合，抑制乳腺癌发生、发展[6]，其是用于内分泌辅助治疗激素受体阳性、HER-2阴性乳腺癌患者的常用药物，可降低疾病复发和扩散，提高患者生存率[7]。大约50%长期使用他莫昔芬的乳腺癌患者可产生继发性耐药。而联合用药可降低细胞耐药性，同时增加乳腺癌细胞对药物的敏感性[8-9]。本实验以帕博西尼联合他莫昔芬对人乳腺癌细胞T-47D进行干预，探讨二者联合使用对其细胞增殖、凋亡和免疫功能的影响及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

全自动酶标仪购自美国Molecular Devices公司；Western blot电泳仪和转膜仪购自美国Bio-rad公司；FACScan流式细胞仪购自美国BD公司；高速冷冻离心机购自美国Beckman Coulter公司；恒温CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要试剂与药品

RPMI1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；MTT试剂、鼠抗β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司；10% SDS溶液、蛋白酶抑制剂、蛋白定量试剂盒、荧光标记二抗购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Annexin V-FITC/PI流式凋亡试剂盒购自美国BD公司；Bax多克隆抗体、cyclin D1多克隆抗体、Bcl-2多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；cleaved-caspase3购自美国Protein tech公司；荧光标记二抗、Odyssey红外激光成像系统购自美国LI-COR公司；ELISA检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。他莫昔芬(tamoxifen)购自阿斯利康投资(中国)有限公司；帕博西尼(palbociclib/PD0332991)购自美国Selleck Chemicals公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养

将人乳腺癌细胞T-47D(上海细胞生物研究所)培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，且置于含5% CO2的37 ℃培养箱中常规培养，待细胞生长至对数期可用于实验。

1.3.2MTT法检测各组药物浓度对细胞增殖的影响

用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期T-47D细胞，以每孔5×103个细胞/100 μL的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后加药处理，帕博西尼组按照浓度梯度0、10、25、50、100 nmol/L处理，他莫昔芬组按照0、5、10、25、50 nmol/L浓度梯度处理，每组3个平行孔。细胞处理24 h后进行MTT检测。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培养箱孵育4 h后终止培养，弃上清液，加入100 μL DMSO 10 min后，酶标仪检测490 nm处吸光度(A值)并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。计算药物对细胞生长的半数抑制浓度(inhibitory concentration 50,IC50)值。后续实验均以帕博西尼和他莫昔芬IC50值为细胞给药浓度。

使用金氏公式[10]计算帕博西尼和他莫昔芬联合用药的Q值。Q=Ea+b/(Ea+Eb- EaEb)，其中Ea和Eb分别为单独药物作用的抑制率，Ea+b为两药联合作用的抑制率。Q>1.15表示两药联合具有协同作用，0.85～1.15表示两药联合具有相加作用，<0.85表示两药联合具有拮抗作用。进行3次独立重复实验。

1.3.3流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞5×104个，按照细胞凋亡试剂盒(Annexin V-FITC/PI双染)说明书操作，检测细胞凋亡情况。

1.3.4流式细胞术检测细胞周期分布

收集各组细胞5×104个，按照细胞周期试剂盒(PI单染)说明书操作，检测细胞周期分布情况。

1.3.5Western blot检测蛋白表达

收集各组细胞，加入裂解液后超声破碎，提取总蛋白。BCA测定蛋白浓度后，等量上样。蛋白电泳，转膜，封闭后加入一抗，4 ℃孵育过夜。PBST漂洗5 min×3次，加入二抗溶液，室温孵育1 h。PBST漂洗5 min×3次，使用Odyssey凝胶成像仪检测蛋白显色情况，Image J定量蛋白条带。

1.3.6ELISA检测细胞免疫抑制细胞因子分泌情况

各组药物作用细胞24 h后，取细胞培养液按照ELISA试剂盒说明书操作，检测免疫抑制细胞因子分泌水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 单药和联合用药对T-47D细胞增殖的影响

使用帕博西尼和他莫昔芬分别处理T-47D细胞24 h后的IC50分别为45.26 nmol/L和12.57 nmol/L。单独用药对T-47D细胞增殖抑制作用与药物浓度呈正相关。与单药组比较，联合用药组对细胞的增殖抑制作用明显增加，经金氏公式检验，Q值在(1.28±0.20)和(1.63±0.23)之间，提示帕博西尼和他莫昔芬联合用药对T-47D细胞具有明显的协同作用，见图1。

图1 不同浓度的药物单独及联合作用24 h后对T-47D细胞增殖的影响

2.2 单药和联合用药对T-47D细胞凋亡和相关蛋白表达的影响

对照组、帕博西尼组、他莫昔芬组、联合用药组细胞凋亡率分别为(9.23±0.18)%、(17.69±1.52)%、(23.67±2.71)%和(36.42±3.48)%。联合用药组较单药组细胞凋亡率明显增加，见图2A。与对照组比较，帕博西尼组、他莫昔芬组及联合用药组细胞中，Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax和cleaved-caspase3蛋白表达明显升高，联合用药组变化更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2B。

A：各组细胞凋亡率比较；B：各组相关蛋白表达。

2.3 单药和联合用药对T-47D细胞周期及相关蛋白表达的影响

帕博西尼组阻滞[(39.36±2.51)%]细胞于G1/S期，他莫昔芬组阻滞[(48.52±1.17)%]细胞于G0/G1期,联合用药组阻滞[(62.36±5.31)%]细胞于G1/S期,见图3A。与对照组比较，帕博西尼组、他莫昔芬组及联合用药组cyclin D1和p-Rb蛋白表达明显降低，联合用药组变化更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3B。

表1 各组药物对T-47D细胞TGF-β1、IL-10、PD-L1水平的影响

2.4 单药和联合用药对T-47D细胞免疫抑制细胞因子分泌水平的影响

与对照组比较，帕博西尼组、他莫昔芬组、联合用药组转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素10(IL-10)、程序性死亡配体1(PD-L1)水平均明显降低，联合用药组降低更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

A：各组细胞周期情况；B:各组细胞周期相关蛋白表达。

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌细胞过度增殖、迁移和侵袭与疾病复发转移紧密相关。CDK4和CDK6是细胞周期关键调节因子，触发细胞周期从G1期(DNA合成前期)到S期(DNA合成期)，CDK4/6过度活跃可导致细胞增殖失控。帕博西尼是CDK4/6抑制剂，能够与 CDK4/6结合，抑制RB磷酸化进而抑制转录因子E2F释放，阻碍细胞由G1期进入S期，从而抑制肿瘤细胞DNA合成和细胞增殖[11]。临床研究发现，在激素受体阳性、HER-2阴性、内分泌治疗复发的晚期乳腺癌患者中，帕博西尼疗效优于安慰剂[12]。他莫昔芬是临床上用于乳腺癌内分泌治疗的主要药物。有研究发现，在激素受体阳性、HER-2阴性乳腺癌患者中，帕博西尼联合内分泌治疗可提高肿瘤细胞药物敏感性，降低耐药性，疗效更好[11]。因此，本文主要研究帕博西尼联合他莫昔芬对乳腺癌细胞T-47D细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和分泌免疫抑制细胞因子功能的影响及其相关机制。

MTT实验结果表明，帕博西尼和他莫昔芬对T-47D细胞的增殖具有协同抑制作用。帕博西尼通过改变细胞周期来抑制细胞增殖[13]，他莫昔芬是通过阻断雌激素作用于乳腺癌细胞的信号通路来抑制细胞增殖[14]，而联合用药可能通过双重机制协同抑制细胞增殖，降低细胞耐药性，提高疗效。本实验使用流式细胞术和Western blot检测进一步证实，帕博西尼和他莫昔芬联合用药能够更加明显抑制G1期T-47D细胞的生长，且细胞周期相关蛋白cyclin D1和p-Rb蛋白表达明显降低。

流式细胞术和Western blot检测结果表明，帕博西尼、他莫昔芬单药和联合用药均可诱导细胞凋亡，且联合用药细胞凋亡更加明显。这可能是由于联合用药使T-47D细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低更明显，促凋亡蛋白Bax和剪切型caspase3蛋白表达明显升高引起的[15-16]。

肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤细胞在肿瘤微环境的保护下，可不被机体免疫系统发现、识别和杀伤，其在肿瘤增殖、转移和侵袭过程中具有重要作用[17]。免疫抑制细胞因子如TGF-β1、IL-10、PD-L1等是肿瘤微环境的主要成分，对肿瘤细胞的增殖和耐药具有重要影响。MA等[18]研究发现上调S180实体瘤小鼠模型体内TGF-β1和IL-10水平可促进肿瘤细胞免疫逃逸。李丽煌[19]研究发现，乳腺癌患者病理组织中PD1/PD-L1 阳性表达率均高于70%，且容易造成肿瘤进展，PD1/PD-L1 阳性患者淋巴结转移率更高，3年生存率明显降低。本研究发现，与对照组比较，帕博西尼和他莫昔芬单药均可明显降低TGF-β1、IL-10和PD-L1水平，但联合用药对免疫抑制细胞因子的下调更加明显。这提示帕博西尼与他莫昔芬联合用药可协同减弱乳腺癌细胞免疫逃逸。

综上所述，帕博西尼与他莫昔芬联合用药可明显抑制乳腺癌细胞T-47D增殖，促进其凋亡，其机制可能与阻滞细胞周期，下调抗凋亡蛋白表达，上调促凋亡蛋白表达，下调肿瘤免疫抑制细胞因子水平等有关，两药联合可协同发挥抗肿瘤作用。