干扰FAM201A通过调控miR-146a-5p/GATA6影响直肠癌细胞生物学行为

张丽 董巧云 宋荣 侯丽 陶菊花

(1巴彦淖尔市医院消化内科，内蒙古 巴彦淖尔 015000；2巴彦淖尔市临河区人民医院；3巴彦淖尔市医院肿瘤中心)

直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，放射治疗是局部晚期直肠癌治疗的方式之一，联合手术治疗可降低局部复发率，提高患者总生存率〔1,2〕；然而放射抵抗性的出现降低了放疗效果，提高癌细胞的放射敏感性是提高其治疗效果的重要途径和方法。研究发现长链非编码RNA(lncRNA)可通过调节各种机制影响放射敏感性，有望在将来成为放射治疗的潜在治疗靶标〔3〕。序列相似性201家族成员(FAM201)A是一种新型的lncRNA，研究报道抑制FAM201A可在体外抑制肺鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并在体内抑制肿瘤的生长〔4〕。FAM201A在放射抵抗的非小细胞肺癌患者组织中显著上调，与患者放射抵抗和生存期降低密切相关；沉默FAM201A在体外和体内均可在X射线照射下抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡〔5〕。抑制lncRNA FAM201A通过靶向miR-488-3p可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进胃癌细胞凋亡，并增加其放射敏感性〔6〕。然而FAM201A对直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响尚不清楚。

miR-146a-5p是miR-146a家族中主要成员之一，研究报道miR-146a-5p在结直肠癌中失调表达，可作为检测结直肠癌的非侵入性生物标志物〔7〕。miR-146a-5p可通过影响结直肠癌细胞的细胞周期进程而发挥抑癌作用〔8〕。miR-146a-5p可以通过激活DNA修复途径和抑制复制蛋白(RP)A3来抑制肝癌细胞的增殖，并促进放射敏感性和凋亡〔9〕。表明miR-146a-5p可抑制结直肠癌进展，还可影响肿瘤放射敏感性。本实验通过在线软件预测发现miR-146a-5p和人GATA结合蛋白(GATA)6有结合位点；GATA6基因位于染色体18q11.1～q11.2上，在多种肿瘤中作为促癌基因〔10〕。GATA6蛋白在结肠癌组织中表达量增加，与患者预后有关〔11〕。miR-455过表达通过靶向GATA6抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭〔12〕。抑制GATA6显著增加了辐射诱导的结肠癌细胞HT55和HT29凋亡〔13〕。然而miR-146a-5p是否通过调控GATA6影响直肠癌进展及放射敏感性尚不清楚，且FAM201A对直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响是否与miR-146a-5p和GATA6有关也不清楚。因此，本实验旨在研究FAM201A对直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响及其机制是否与miR-146a-5p和GATA6有关。

1 材料与方法

1.1临床组织来源 选取内蒙古巴彦淖贝尔市医院外科手术切除的23例直肠癌患者癌组织及癌旁正常黏膜组织，男13例、女10例，年龄40～61岁，平均(47.63±3.47)岁;病程1～3年，平均(1.02±0.54)年，分期1期8例，2期10例，3期5例。所有患者手术前未进行过放化疗，患者均知情且同意。

1.2材料 直肠癌细胞SW837购自美国ATCC；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自美国invitrogen公司；荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司；蛋白提取试剂盒购自亚科因(武汉)生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAT Bioquest公司。

1.3细胞处理与分组 直肠癌细胞SW837用RPMI1640培养基常规培养，将si-NC、si-FAM201A、miR-NC、miR-146a-5p转染至SW837细胞中，记为si-NC组、si-FAM201A组、miR-NC组、miR-146a-5p组；将si-FAM201A分别与anti-miR-NC、anti-miR-146a-5p共转染至SW837细胞中，记为si-FAM201A+anti-miR-NC组、si-FAM201A+anti-miR-146a-5p组。

1.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FAM201A、miR-146a-5p和GATA6 mRNA的表达水平 提取直肠癌组织、癌旁组织及细胞的总RNA，合成cDNA后按荧光定量试剂盒说明进行PCR，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和U6为内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达量。FAM201A上游引物：5′-CCAGGCTCTTTGATCACCAT-3′，下游：5′-GAGTTTCCTGGGATGTGGAA-3′；miR-146a-5p上游引物：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游：5′-CCCA TGGAATTCAGTTCTCATT-3′；GATA6上游引物：5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′，下游：5′-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-TCA CCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游：5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′；U6上游引物：5′-CAAGGATGACACGCAAA-3′，下游：5′-TCAACTGGTGTCGTG-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5克隆形成实验 将1.3中各组细胞以适宜密度接种于培养皿中，细胞融合达至80 %左右，分别给予0、2、4、6、8 Gy的射线照射，继续培养约2 w，用吉姆萨染色30min，在低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。克隆形成率(PE)=克隆数/接种细胞数×100%，存活分数(SF2)=照射剂量组的集落数/(该组细胞接种数×未照射组PE)。采用GraghPad Prism5软件，按单击多靶模型拟合细胞存活曲线，SF2=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D为照射剂量(Gy)，D0为平均致死剂量，Dq为准阈剂量(代表存活的宽肩度)，N为外推值。放射增敏比(SER)=单纯照射组D0/联合照射组D0。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡1.3中各组细胞接种于6孔板中。分别给予0、4 Gy的射线照射，继续培养48 h 按试剂盒说明操作，置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7Western印迹法检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔上样40 μl蛋白样品，电泳结束后进行转膜，然后用脱脂奶粉封闭，洗膜后加入一抗孵育，然后加入二抗室温孵育，加入化学发光液显影，然后定影、成像；用Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.8双荧光素酶报告实验 构建FAM201A及GATA6的野生型和突变型荧光素酶报告载体，将其分别与miR-146a-5p及miR-NC共转染至直肠癌细胞SW837中，按试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1FAM201A、miR-146a-5p和GATA6在直肠癌组织中的表达 与癌旁组织相比，直肠癌组织中FAM201A和GATA6 mRNA表达水平显著升高，miR-146a-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2干扰FAM201A对直肠癌细胞放射敏感性及凋亡的影响 与si-NC组相比，si-FAM201A组0 Gy、4 Gy直肠癌细胞集落形成数及2、4、6、8 Gy细胞存活率显著减少，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2、表3、图1。单击多靶模型拟合计算得出(表4)，si-FAM201A组SER为1.885。

表1 FAM201A、miR-146a-5p 和GATA6 在直肠癌中的表达

表2 干扰 FAM201A 对直肠癌细胞存活率的影响

表3 干扰FAM201A对直肠癌细胞集落形成、凋亡及FAM201A、miR-146a-5p、GATA6表达的影响

A：干扰FAM201A抑制直肠癌细胞集落形成(吉姆萨染色，×40)；B：干扰FAM201A诱导直肠癌细胞凋亡

表4 si-NC组与si-FAM201A组SER

2.3干扰FAM201A对直肠癌细胞miR-146a-5p、GATA6表达的影响 与si-NC组相比，si-FAM201A组FAM201A表达水平显著降低，miR-146a-5p表达水平显著升高，GATA6 蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表2、图2。

2.4miR-146a-5p对直肠癌细胞放射敏感性及凋亡影响 与miR-NC组相比，miR-146a-5p组miR-146a-5p表达水平升高，GATA6 蛋白表达水平降低，直肠癌细胞集落形成数减少，细胞凋亡率升高，2、4、6、8 Gy细胞存活率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3～5、表5、表6。单击多靶模型拟合计算得出(表7)，miR-146a-5p组的SER为2.109。

图2 GATA6蛋白表达

图3 Western印迹检测GATA6蛋白表达

图4 miR-146a-5p抑制直肠癌细胞集落形成(吉姆萨染色，×40)

图5 miR-146a-5p诱导直肠癌细胞凋亡

表5 miR-46a-5p对直肠癌细胞存活率的影响

表6 miR-146a-5p对直肠癌细胞集落形成及凋亡的影响

表7 单机多靶参数

2.5抑制miR-146a-5p可逆转干扰FAM201A对直肠癌细胞放射敏感性及凋亡影响 与si-FAM201A+anti-miR-NC组相比，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p组miR-146a-5p表达水平降低，GATA6 蛋白表达水平升高，直肠癌细胞集落形成数增加，细胞凋亡率及2、4、6、8 Gy细胞存活率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图6～8、表8、表9。单击多靶模型拟合计算得出(表10)，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p组的SER为0.542。

2.6FAM201A、miR-146a-5p和GATA6的靶向关系 Starbase软件预测显示FAM201A与miR-146a-5p具有结合位点，targetscan软件预测显示miR-146a-5p与GATA6具有结合位点(图9)。双荧光素酶报告实验结果显示，WT-FAM201A或WT-GATA6与miR-146a-5p共转染后的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而MUT-FAM201A或MUT-GATA6与miR-146a-5p共转染后的细胞荧光素酶活性无明显变。见表11。

1，2：si-FAM201A+anti-miR-NC组，si-FAM201A+anti-miR-146a-5p组，图7，8同

图7 抑制miR-146a-5p可逆转干扰FAM201A对直肠癌细胞集落形成的抑制作用(吉姆萨染色，×40)

图8 抑制miR-146a-5p可逆转干扰FAM201A诱导直肠癌细胞凋亡

表8 抑制miR-146a-5p可逆转干扰FAM201A对直肠癌细胞集落形成及凋亡的影响

表9 miR-46a-5p对直肠癌细胞存活率的影响

表10 单机多靶参数

图9 FAM201A、miR-146a-5p和miR-146a-5p、GATA6的互补序列

表11 双荧光素酶报告实验

3 讨 论

放射治疗是肿瘤的重要治疗手段之一，但目前面临着肿瘤放疗抵抗的难题，如何增强肿瘤的放射敏感性，提高放射治疗效果是亟需解决的问题〔14〕。研究肿瘤放射敏感性的分子机制，寻找潜在的增敏靶点进而提高放射敏感性是重要方法〔15〕。研究报道FAM201A在耐辐射食管鳞癌组织中表达上调，其表达增加与食管鳞癌的抗辐射性和低存活率密切相关，FAM201A通过miR-101调节ATM和mTOR表达介导食管鳞状细胞癌的放射敏感性〔16〕。FAM201A通过miR-186-5p/TNKS1BP1轴增强三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并加速细胞凋亡〔17〕。本实验结果说明干扰FAM201A可抑制直肠癌细胞增殖，促进细胞凋亡，干扰FAM201A可提高直肠癌细胞对射线的敏感性。

研究报道miR146a-5p通过羧肽酶(CP)M/src-局部黏着斑激酶(FAK)途径促进人结直肠癌中的细胞迁移和侵袭〔18〕。本实验结果表明过表达miR-146a-5p可抑制直肠癌细胞增殖，促进细胞凋亡。研究报道miR-146a-5p过表达可增强卵巢癌细胞OVCAR3、SKOV3对顺铂的敏感性〔19〕。本实验结果表明过表达miR-146a-5p可增强直肠癌细胞的放射敏感性。研究报道miR-944过表达通过靶向GATA6抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移〔20〕。本实验结果提示，miR-146a-5p可能通过靶向调控GATA6影响直肠癌进展。

研究报道lncRNA电压门控钾通道亚家族Q1重叠转录物(KCNQ1OT1)通过miR-146a-5p/碱性神经酰胺酶(ACER)3轴抑制放射敏感性并促进肝细胞癌的发生〔21〕。lncRNA可通过调控miR-146a-5p影响肿瘤进展及放射敏感性。本实验发现，FAM201A可靶向调控miR-146a-5p；而抑制miR-146a-5p可逆转干扰对直肠癌细胞集落形成，凋亡及放射敏感性的影响，提示，FAM201A可能通过调控miR-146a-5p影响直肠癌进展。

综上所述，干扰FAM201A可通过调控miR-146a-5p/GATA6抑制直肠癌细胞集落形成，促进细胞凋亡，增强其放射敏感性。