miRNA-194-5p通过减少神经炎症降低脑卒中风险

王霞 李美 王冰 陈秋菊 李岩 刘振元 张文奇

(衡水市人民医院(哈励逊国际和平医院)康复医学科，河北 衡水 053000)

在血管风险高发、人口统计学巨变(老龄化、城市化)、生活方式欠佳(久坐、饮食)和经济快速发展的背景下，脑卒中的发病率、致残率、死亡率呈升高趋势，已成为威胁中老年人健康的一大公害〔1〕。急性缺血性脑卒中(AIS)作为一种危重的医学急症，其病因尚未确定，目前需要利用多种评估工具进行及时的评估，包括非对比头颅电子计算机断层扫描(CT)检查、磁共振成像(MRI)评估量表，这些评估工具非常有效，但也有其局限性，比如对特定脑区的敏感性有限〔2〕。在AIS的治疗方面，脑卒中后4.5 h内静脉注射重组组织纤溶酶原激活剂仍是临床首选，而由于缺乏对院前脑卒中症状的快速识别，AIS患者的及时干预常常受到阻碍〔3〕。

微小RNA(miRNAs)被认为是重要的调节因子，可以作为人类疾病的诊断生物标志物或治疗靶点，为研究潜在的新治疗方法提供了机会。很多研究表明miRNAs可以通过调节血管生成参与AIS的形成〔4，5〕。miRNA-194-5p已经在多种癌症中得到了很好的研究，并且在顺式细胞癌患者中也被证实是下调的〔6〕。也有研究表明在低温氧葡萄糖剥夺处理的神经元中，miRNA-194-5p的表达显著下调，在miRNA-194-5p介导神经元死亡的调控种，其下调对特定靶蛋白SUMO2缺血耐受至关重要，miRNA-194-5p在通过调节SUMO2调节深低温循环停止反应中发挥独特作用。这些发现提示miRNA-194-5p可能是缺血性疾病干预治疗的潜在靶点〔7，8〕。然而，miRNA-194在AIS中的作用尚未见报道。miRNA-194-5p对AIS 及其相关炎症的作用和机制尚不清楚。本研究旨在探索miRNA-194-5p对AIS相关炎症的作用及其可能机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2018年12月衡水市人民医院神经内科就诊的AIS患者72例为脑卒中组，男38例，女34例，年龄58～68岁；同期72例无脑血管病健康志愿者为正常组，男37例，女35例，年龄61～67岁。纳入标准：①临床确诊为AIS，入院前行头部CT排除脑出血；②临床资料完整；③首次发病且于3 d内入院。排除标准：①发病前有颅脑或精神创伤者及合并其他神经系统疾病;②年龄<18岁;③颅内出血或合并梗死后出血;④合并肿瘤及心肺功能不全；⑤合并自身免疫性疾病。取血样，4℃离心10 min，得血清，-80℃保存。经CT或MRI检查证实为AIS。本研究经医院伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意。

1.2实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 使用TRIzol试剂(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，从血清和细胞中收集总RNA。运用RT试剂盒(TaKaRa Bio，Inc)合成cDNA。反应在20 μl体积内进行，每个基因包含1 μl引物(10 μmol/L)、1 μl cDNA、10 μl SYBR Premix EX TaqTM(Takara Bio，Inc)和8 μl无核糖核酸酶水。RT-PCR使用LightCycle®96装置(罗氏，中国上海)进行。用2-ΔΔCt法分析mRNA表达量。

1.3细胞培养 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国Ambion公司。HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中生长，细胞在37℃和5%CO2下孵育。使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，miRNA-194-5p、simiRNA-194-5p、siTRAF6和对照质粒(上海基因制药有限公司)转染HUVECs。①细胞分为正常组和脂多糖(LPS)模型组，培养48 h后，将100 ng/ml LPS加入LPS诱导组HUVECs中，孵育48 h，建立LPS诱导的HUVECs模型，并检测6、12、24、48 h的miRNA-194-5p表达。②将LPS诱导培养48 h的HUVECs分为空白组、miRNA-194-5p组、simiRNA-194-5p组，分别转染相应的质粒，培养12 h后，检测miRNA-194-5p 、炎症因子、TRAF6 mRNA、TRAF6蛋白表达情况。③将LPS诱导培养48 h的HUVECs分为空白组，simiRNA-194-5p组，simiRNA-194-5pa+siTRAF6组，分别转染相应的质粒，培养12 h后，检测TRAF6、炎症因子表达。

1.4双荧光素酶报告分析 使用了miRNA靶点预测软件分析miRNA-194-5p的作用靶点。确定TRAF6的3′-UTR与miRNA-194-5p的结合位点。使用Lipofectamine2000(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)诱导HUVECs转染TRAF6-miRNA-194-5p 和TRAF6-negative 。转染24 h后，使用双荧光素酶分析系统进行报告分析。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA试剂盒用于细胞上清中炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平检测。使用FLUOstar-Omega微孔板阅读器(BMG-Labtech股份有限公司)在450 nm波长处检测吸光度。

1.6Western印迹分析 使用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。然后在10%的凝胶上用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质(50 μg/ml)，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。随后，在室温下用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，用(TRAF)6和GAPDH抗体在4℃孵育12 h。然后用辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG二级抗体孵育膜2 h。使用增强化学发光试剂盒(EMD Millipore)对蛋白质条带进行可视化，并使用密度测定法(Quantity One 4.5.0软件；Bio-Rad Laboratories，Inc)对蛋白进行定量。实验重复3次。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验，方差分析和Tukey检验。

2 结 果

2.1miRNA-194-5p在脑卒中患者血清的表达 脑卒中组miRNA-194-5p表达(0.39±0.15)显著低于正常组(1.00±0.08，P<0.05)。

2.2LPS诱导的HUVECs中miRNA-194-5p的表达 与正常组相比，LPS模型组各时间点miRNA-194-5p表达水平显著下降(均P<0.001)。见表1。

表1 LPS诱导HUVECs中miRNA-194-5p表达

2.3miRNA-194-5p抑制神经炎症发展 与空白组比较，miRNA-194-5p组在miRNA-194-5p质粒作用下显著激活HUVECs miRNA-194-5p表达量(P<0.001)。与空白组比较，激活miRNA-194-5p能够抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。见表2。

表2 激活miRNA-194-5p对HUVECs模型中炎症因子的影响

2.4下调miRNA-194-5p 促进神经炎症发展 与空白组比较，simiRNA-194-5p组在simiRNA-194-5p作用下显著抑制HUVECs miRNA-194-5p表达量(P<0.001)。与空白组比较，下调miRNA-194-5p表达，可明显激活HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。见表3。

表3 下调miRNA-194-5p 对HUVECs模型中炎症因子的影响

2.5miRNA-194-5p通过TRAF6靶点抑制神经炎症发展 miRNA-194-5p与TRAF6的结合位点，见图1。与空白组与TRAF6组比较，miRNA-194-5p与TRAF6的荧光素酶表达量显著偏低(P<0.05)。空白组，激活miRNA-194-5p显著抑制TRAF6 mRNA及蛋白表达，下调miRNA-194-5p显著激活TRAF6 mRNA及蛋白表达(P<0.05)。见图2、图3、表4。

图1 miRNA-194-5p与TRAF6的结合位点

图2 激活miRNA-194-5p显著抑制TRAF6 蛋白表达量

图3 下调miRNA-194-5p显著激活TRAF6 蛋白表达量

表4 miRNA-194-5p通过TRAF6靶点抑制神经炎症发展

2.6调控TRAF6参与miRNA-194-5p抑制神经炎症发展 用siTRAF6显著抑制下调miRNA-194-5p对TRAF6蛋白表达量，与simiRNA-194-5p组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与simiRNA-194-5p组比较，下调TRAF6可显著减少下调miRNA-194-5p对HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响(P<0.05)。见表5、图4。

表5 调控TRAF6参与miRNA-194-5p抑制神经炎症发展

1～3：空白组、simiRNA-194-SP组、simiRNA-194-5p+siTRAF6组

3 讨 论

AIS是世界上神经系统发病率和死亡率的重要原因之一〔9〕。免疫系统在脑缺血损伤后的病理生理变化中起着复杂的作用，脑卒中通过激活自主神经系统和应激轴诱导免疫反应的抑制，显著促进脑卒中相关炎症的发展。免疫应激的生物标志物被认为是预测脑卒中相关感染的可靠指标〔10〕。开发生物标志物来指导脑卒中预后和相关性炎症，将有助于对脑卒中高危患者的监测和预防性抗感染治疗。到目前为止，还没有一种生物标志物或生物标志物模式能够充分预测感染或具有足够的阴性和阳性预测值为临床提供可靠的靶点〔1，10〕。miRNA-194-5p/NXPH1轴在神经炎症相关疾病的发生发展中发挥重要作用。这一发现将为生物医学和神经科学研究开辟新的途径〔11〕。本研究结果说明miRNA-194-5p可能参与脑卒中相关疾病的发生和发展。

miRNAs可能针对数百种不同的mRNAs，调节基因表达，在细胞形成、分化、增殖和凋亡中具有重要作用，很多mRNAs并被认为是参与神经元保护基因表达的关键调控因子〔12〕。研究表明，缺血性脑卒中改变了小鼠和人类多个miRNA的表达，并具有改变细胞应激反应的能力。此外，脑卒中诱导的神经炎症事件，特别是小胶质细胞反应在miRNAs水平上受到调节〔13〕。研究表明NF-κB激活可下调LPS诱导的急性肺损伤(ALI)中miRNA-194的表达。miRNA-194的过度表达减轻了LPS诱导的ALI，并通过靶向CXCR4降低了炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。在LPS诱导的ALI中，NF-κB通过抑制miRNA-194的表达介导CXCR4的表达，从而促进肺组织的炎症损伤〔14,15〕。有人认为在LPS诱导后，miRNA-194在新生儿脐血粒细胞中的表达下调，表明miRNA-194在LPS刺激的TLR信号通路中的作用〔16〕。另一项研究报道miR-194可以通过靶向TRAF6调节棕榈酸诱导的人THP-1细胞TLR4炎症反应〔17〕。此外，miRNA-194还可以通过介导TLR4的表达来调节LPS诱导的NF-κB信号〔18〕。本研究发现，在LPS诱导的HUVECs模型中 miRNA-194-5p的表达被显著抑制，激活miRNA-194-5p能够抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。Chen等〔19〕研究发现，下调miRNA-194-5p表达，HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平被激活。这些表明miRNA-194-5p可以抑制神经炎症，但机制尚不清楚。

TRAFs家族是一种多功能的细胞内因子，最初发现它与细胞中的不同TNF直接结合，并存在于多种生物细胞中〔20〕。TRAF6与典型TRAF蛋白结构同源性最小，TRAF-C结构域差异最大〔21〕。越来越多的证据表明，TRAF6除了作为适应性蛋白外，还可以作为E3泛素连接酶调节下游信号通路。TRAF6可以介导炎症因子信号的表达，在大脑中动脉闭塞模型中发现TRAF6的表达水平明显升高，脑水肿明显，但应用TRAF6抑制剂后，脑梗死面积减小，脑水肿程度减轻，免疫组化和Western印迹检测显示TRAF6的表达也明显减少〔22〕。同样，一些临床试验表明，在AIS患者外周血中，TRAF6作为TLR4信号通路激活后的下游分子，在脑缺血中发挥着最重要的作用，对缺血性脑损伤的预后有重要影响〔23〕。本研究发现，激活miRNA-194-5p显著抑制TRAF6 蛋白表达量。抑制TRAF6表达减少下调miRNA-194-5p对神经炎症发展的作用。 Kong等〔24〕研究发现，miRNA-194调控TRAF6表达，抑制LPS诱导的椎间盘髓核细胞炎症反应。提示，miRNA-194-5p可能通过调控TRAF6，减少神经炎症阻止脑卒中风险。

综上，脑卒中患者血清中miRNA-194-5p表达显著降低，激活miRNA-194-5p能够抑制HUVECs上清中炎症因子。同时miRNA-194-5p通过调控TRAF6靶点，抑制脑卒中相关神经炎症。提示，miRNA-194-5p可能作为临床治疗脑卒中相关神经炎症重要指标，但其作用机制还有待进一步探讨。