基于Notch1/Hes1信号通路探讨葛根素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响

张驰 徐莉 任浩进 徐超 刘金华 王丽岳

(武汉市普仁医院，湖北 武汉 430081)

传统理论认为，心肌梗死发生时心肌细胞的首要表现就是坏死，但根据最新试验证实，长时间缺血会使心肌细胞发生明显凋亡的一系列特征，随后发生坏死〔1〕。心肌细胞凋亡的发生区域包括梗死中心区、边缘区甚至涉及远处的存活心肌细胞。持续进行的细胞凋亡会导致进行性心肌细胞丢失、细胞中胶原支架断开及心室壁的厚度下调，发生心室重构最终演变为心衰。细胞凋亡过程受多基因的共同调控，B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)分别是促进和抑制细胞凋亡的标志性基因，与凋亡过程相关〔2〕。葛根素属于中药葛根中的一种异黄酮化合物，其药理作用广泛，抑炎、抗凋亡、抗氧化及调节血管舒张等，被认为是能够用于治疗心肌梗死、心绞痛、冠心病等一系列心血管病的药用有效成分〔3～5〕。而目前，葛根素对于心梗造模大鼠的心脏一系列功能的影响和涉及的生物学机制尚不明确。缺刻基因(Notch)1/发状分裂相关增强子(Hes)1信号通路属于一条保守进化的生物胞间转导通路，研究发现其对于细胞增殖、生长、分化和组织器官发育发挥一定作用，该通路活化也与多种炎症、氧化应激反应过程密切相关〔6～8〕。有研究指出，激活Notch1/Hes1通路能够具有心肌保护效应，而其是否参与了心肌梗死中的心肌保护过程未见相关报道〔9〕。本研究建立心肌梗死大鼠模型，基于Notch1/Hes1信号通路探讨葛根素对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响。

1 材料与方法

1.1一般材料 雄性Wistar大鼠(购自中国科学院生物研究所)、葛根素(购自四川玉鑫药业有限公司)、戊巴比妥(购自陕西汉江药业股份有限公司)、HE染液(索莱宝科技有限公司)、Notch1的胞内片段(NICD)一抗及二抗、Hes1一抗及二抗、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)一抗及二抗、p-蛋白激酶B(Akt)一抗及二抗、Bcl-2一抗及二抗、Bax一抗及二抗(购自北京奥维亚生物技术有限公司)、原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测试剂盒(购自武汉普健生物科技有限公司)、蛋白酶K(购自武汉普健生物科技有限公司)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂(购自上海双赢生物科技有限公司)。

1.2模型制备 制备心肌梗死大鼠模型时，首先使用3%质量分数的戊巴比妥(剂量为40 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，进行口气管固定之后连接呼吸机，从大鼠的左侧3～ 4肋骨间一步步打开胸腔及心包，待心脏暴露出来，使用丝线对大鼠冠脉前降支进行结扎，通过心电图可以观察到ST段明显抬高，心脏左室前壁发白，模型建造成功后，使肺部完全膨胀，排出胸腔的气体进行胸腔关闭。

1.3分组 将96只雄性Wistar大鼠(200～250 g)随机分成3组：对照组：进行假手术，穿线操作相同但不进行结扎；模型组：按照模型制备操作结扎大鼠心脏冠脉；葛根素干预组：同模型组进行模型制备后24 h进行腹腔注射葛根素120 mg/(kg· d)，对照组和模型组均腹腔注射与其等量的生理盐水，1次/d。3组按照术后1、2、3、4 w记录各时间点血液流变学指标后处死大鼠，每组每个时间点8只大鼠。

1.4血液流变学指标检测 对大鼠麻醉处理固定后进行右颈总动脉的分离，插入PE-50导管于颈部总动脉，待数值稳定观察动脉收缩压(SBP)，再将导管移入左心室，通过BL-420生物机能实验系统对左室舒张末期压(LVEDP)、左室压上升(下降)最大速率(±dp/dt max)进行测量。

1.5大鼠心脏质量和心肌梗死面积检测 各组大鼠处死后得到心脏，使用0.85%氯化钠洗涤吸干水分后进行全心重量(THW)、左心室的实际重量(LVW)称量，分别除以大鼠整体体重(BW)，两者比值能够提示全心、左心室肥厚程度。沿左室长轴的垂直线将其均分4份，每一份中选取5 μm心脏组织行苏木素-伊红(HE)染色，成像后进行分析，取心内、外膜表面的梗死瘢痕弧长和心内、外膜表面周长的均值。心肌梗死面积=(瘢痕外弧长+瘢痕内弧长)/(内周长+外周长)× 100%。

1.6制备心肌组织切片 各组大鼠处死后得到心脏，浓度为0.85%的氯化钠进行反复冲洗后再运用10%的甲醛进行细胞24 h固定，经过石蜡包埋处理对心梗病灶周围1 mm以内的心肌组织沿左室轴线进行4 μm厚石蜡切片处理，进行HE染色显微镜下观察，并通过Western印迹法检测Notch1/Hes1信号通路蛋白及Bcl-2、Bax蛋白表达。

1.7检测心肌细胞凋亡 通过TUNEL选取各组切片各5张，按照TUNEL试剂盒操作说明书进行检测。首先进行固定包埋切片，随后脱蜡处理，运用H2O2封闭处理0.5 h，使用浓度为25 mg/L的蛋白酶K对膜、核蛋白进行消化，再向其中加入一定量的TUNEL反应液，室温条件下孵育1 h，添加抗荧光素抗体及DAB显色试剂，经过苏木素复染、脱水、透明操作后进行封片。在400倍视野观察每张切片的5个不同视野总细胞数和细胞凋亡数目，凋亡系数=细胞凋亡数/总细胞数。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行SNK-q检验及方差分析。

2 结 果

2.1心肌梗死大鼠模型的制备结果 建立心肌梗死大鼠模型后，大鼠的整体死亡率为34.50%，模型组死亡率为16.50%，葛根素干预组死亡率为14.80%，模型组和葛根素干预组比较无统计学差异(P>0.05)，模型制备结束后对模型组大鼠进行开胸检查发现心脏肥大，左心室的游离壁上一部分心脏肌肉变薄、发白，同时可见心肌梗死灶存在。见图1。

A：大致观察；B：光学显微镜下观察(×200)，箭头指向心肌梗死灶

2.2各组血液流变学指标 模型组及葛根素干预组血液LVEDP较相同时间的对照组显著上升(P<0.05)，±dp/dt max及SBP则明显下调(P<0.05)。3 w时，葛根素干预组+dp/dt max和SBP较相同时间的模型组显著上升(P<0.05)，LVEDP则明显下降(P<0.05)；2 w时，葛根素干预组-dp/dt max较相同时间的模型组显著上升(P<0.05)。见表1。

2.3各组心肌梗死面积及左心室重量比较 术后不同时间点各组BW无统计学差异(P>0.05)，模型组和葛根素干预组心肌梗死面积差异显著(P<0.05)。术后4 w时，模型组THW/BW、LVW/BW数值较对照组显著上升(P<0.01)，使用葛根素干预可以显著削减心肌梗死模型大鼠左心室肥大现象(P<0.05)。见表2。

表1 各组血液LVEDP、SBP、+dp/dt max、-dp/dt max比较

表2 各组心梗面积及左心室重量的比较

2.4各组心肌细胞凋亡结果 光学显微镜下不同程度染色的棕褐色代表凋亡心肌细胞核，轮廓清晰，蓝色染色的代表正常心肌细胞核，而心肌坏死细胞的轮廓结构不清晰。术后1 w对照组心肌梗死灶附近未出现细胞凋亡现象，心肌细胞核呈现蓝色，葛根素干预组及模型组均出现心肌细胞凋亡现象，葛根素干预组心肌凋亡细胞核数比模型组显著下调，凋亡着色变浅。葛根素干预组心肌梗死灶附近的凋亡心肌细胞均比相同时间点模型组显著下降(P<0.01)。见图2、表3。

图2 手术后1 w各组心肌细胞凋亡状况(TUNEL染色，×400)

表3 不同时间模型组和葛根素干预组心肌细胞凋亡系数对比

2.5各组Bax/Bcl-2比值随时间的变化 术后1、3、4 w时，模型组Bax/Bcl-2数值较相同时间的对照组显著上升(P<0.05)，术后3、4 w时，模型组的Bax/Bcl-2数值较同组术后1 w时显著上升，且4 w时上升更加显著(P<0.05)，4 w时，葛根素干预组Bax/Bcl-2数值较模型组显著下降(P<0.05)。见表4。

表4 不同时间点各组心肌细胞Bax/Bcl-2变化

2.6各组Notch1/Hes1信号通路蛋白表达比较 干预4 w后，模型组心肌组织中的NICD、Hes1及PTEN蛋白及p-Akt表达与对照组有统计学差异(P<0.01)；葛根素干预组心肌组织中的NICD、Hes1、p-Akt/Akt、PTEN蛋白表达均与对照组和模型组存在显著性差异(均P<0.01)。见表5、图3。

表5 各组干预4 w后Notch1/Hes1信号通路蛋白表达比较

图3 各组Notch1/Hes1信号通路蛋白表达比较

3 讨 论

研究发现，心肌梗死主要病理机制涉及冠状动脉闭塞所引发的心肌组织缺氧及缺血。心肌梗死也是导致心脏功能损伤的主要原因，严重情况下会使患者在短时间内发生死亡。心肌梗死的病理表现同时包括心肌大面积坏死及心肌收缩力减弱，从而导致供血不足及其他恶性并发症的发生，对于患者的生活品质产生严重影响。所以，对于防治心肌梗死的相关课题一直是学术研究的热点〔10～12〕。心肌梗死一般会在急性缺血期出现细胞死亡现象，并且在亚急性、慢性期丢失存活细胞，以上现象主要与心肌细胞的凋亡有关。心肌细胞发生凋亡后会被纤维组织及成纤维细胞取代，促进了心力衰竭的进展及心功能减退。相关研究发现，抑制心肌梗死模型鼠的心肌细胞凋亡能够显著改善心脏功能，抑制心肌细胞的病理变化，同时显著阻止心肌的受损〔13〕。所以，控制心肌细胞发生凋亡将会是治疗心肌梗死的可行性方法。葛根素属于传统中草药葛根中的重要活性成分，其多重药理活性包括促进血流微循环、舒张血管、抗感染、抗氧化及抗凋亡等，所以其在高血压、心脏病、心绞痛、心肌受损等一系列心血管病中能够发挥重要作用〔14〕。有研究报道指出，葛根素能够显著抑制慢性心衰模型大鼠的心肌炎症及心肌细胞凋亡，明显提高模型鼠生存率并改善心功能。另外有试验发现，葛根素能够显著控制糖尿病模型鼠被诱导的心肌细胞凋亡，控制心肌梗死面积从而进行对心脏的保护作用〔15〕。

研究发现，心肌梗死发生之后，心肌梗死的周边区域细胞凋亡显著。本次研究结果提示，葛根素于早期即能够保护一部分心肌，细胞凋亡数随时间推移显著下调。凋亡过程是受相关基因调控的，激发、抑制均受不同基因的控制，Bax、Bcl-2基因分别促进和抑制细胞的凋亡。Bcl-2/Bax数值即能够体现细胞存亡，Bcl-2蛋白水平的上调会使Bax/Bcl-2下调，表明细胞凋亡被抑制，细胞能够存活，相反，Bax蛋白的过度表达促进细胞死亡〔16～18〕。本研究结果提示，心肌细胞缺血受损时Bcl-2马上被启动，Bcl-2基因产物能够逆转心肌细胞凋亡过程，对心肌梗死中的存活细胞进行保护，心肌梗死的慢性时期，增生胶原纤维促使梗死附近的心肌组织缺氧、缺血，诱导了凋亡发生过程，促进Bax的表达过度。本研究发现，葛根素主要在后期抑制细胞凋亡，并且随时间推移，心肌细胞凋亡显著下降。

心肌梗死发生时的心室重构过程属于心脏对血液流变学变化的代偿反应，阻止细胞凋亡、降低细胞进行丢失概率，会显著改善左心室的功能〔19～21〕。本研究表明，心脏的弹性功能受到明显损伤，提示葛根素在后期发挥主要作用，下调左室的充盈压，进行左心室功能改善。本研究结果提示，心肌梗死的面积大小取决于心梗发生的开始短时期，葛根素作为中药成分可能药效作用缓慢。同时，长时间运用葛根素干预能够减轻全心、左心肥大，心室重构过程得到抑制。此外，葛根素干预能够明显激活Notch1/Hes1信号通路的表达。

综上，心肌梗死大鼠心肌细胞会发生明显凋亡现象，并且伴随左心室功能降低，使用葛根素进行干预能够通过促进Bcl-2抑制Bax基因的表达一定程度上减轻心肌细胞凋亡，有助于左心室功能改善以及减轻心室重构，这些过程与其激活Notch1/Hes1信号通路的表达密切相关。