Nrf2/HO-1和Smad通路在HIRI介导肝纤维化早期形成的作用

杨洋 宋千黛 赵婧瑶 仝琳鸽 叶圣莹 秦燕

(大理大学基础医学院生理与病理生理学教研室，云南 大理 671000)

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程，是肝硬化的必经阶段。肝纤维化可以逆转，而肝硬化不可逆，因此逆转、延缓甚至阻断肝纤维化是临床研究的热点〔1，2〕。肝缺血再灌注损伤(HIRI)常见于休克、肝外科手术等，其发生与氧化应激反应、细胞因子释放、炎性细胞浸润等密切相关，而这些因素又可以激活肝星状细胞(HSC)，启动肝纤维化〔3，4〕。可见HIRI与肝纤维化密切相关，利用HIRI诱导肝纤维化符合疾病的自然进程。

肝缺血后从再灌注开始到6 h内的急性损伤阶段〔5，6〕，主要表现为Kuffer细胞激活，释放活性氧簇(ROS)和炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1等，共同介导肝脏的氧化应激损伤。核因子E2相关因子(Nrf)2是维持氧化还原稳态的主要细胞调节因子，是保护器官免受氧化应激损伤的胞内信号相关的重要转录因子〔7，8〕，在ROS刺激下Nrf2引起抗氧化反应元件调节基因的转录激活，调控Ⅱ相代谢酶、抗氧化酶等，发挥抗氧化作用。血红素加氧酶(HO)-1是Nrf2下游的抗氧化酶，具有抗氧化、改善组织微循环等作用。已证明Nrf2/HO-1通路激活对HIRI具有保护作用〔9〕。转化生长因子(TGF)-β-Smad通路是促肝纤维化形成的最重要的信号通路。本研究基于Nrf2/HO-1和Smad通路探讨HIRI介导肝纤维化早期启动的初步机制，为进一步完善肝纤维化机制提供一定依据。

1 材料与方法

1.1材料 C57雄性小鼠，体重20～25 g，SPF级，购自昆明医科大学实验动物中心。药物与试剂：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1单克隆抗体购于Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔免疫球蛋白(Ig)G购于北京中杉生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器 奥地利安图2010酶标仪(奥地利安图斯公司)；ABIStepOnePlusPCR扩增仪(美国应用生物系统公司)；T6紫外分光光度计(北京普析)；组织研磨器(北京诺博莱德科技有限公司)；免疫印迹电泳系统(美国Bio-Rad)。

1.3动物分组及模型制备 将24只C57雄性小鼠分为正常对照组(n=6)和模型组(n=18)。其中模型组根据再灌注后0 h、3 h、6 h，分为模型组0、3及6 h组。模型组用动脉夹夹闭肝门静脉、入肝中叶和左叶的肝动脉90 min，开夹后，分别再灌注0 h、3 h和6 h。

1.4指标检测及方法 检测血浆中ALT、LDH和GSH-Px含量；测定肝组织SOD、MDA含量；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中IL-6、IL-1b、TNF-α、α-SMA、HO-1、Nrf2和TGF-β1含量；Western印迹检测肝组织 α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad7的蛋白表达量；苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态学变化。

1.5统计学分析 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组血浆中ALT、LDH水平变化 与对照组相比，模型组血浆ALT、LDH水平均明显升高(P<0.05)，提示缺血再灌注后0、3、6 h，肝细胞发生严重损伤。见表1。

2.2各组肝组织SOD、MDA水平及血浆GSH-Px活力变化 与对照组相比，模型组肝组织SOD含量均有不同程度的降低(P<0.05)，而MDA含量则呈不同程度的升高(P<0.05)。表明模型组小鼠肝组织抗氧化能力降低，脂质过氧化水平升高。模型组血浆GSH-Px活力较对照组呈不同程度降低(P<0.05)。见表1。

2.3各组肝组织IL-6、IL-1b、TNF-α mRNA表达水平变化 RT-PCR结果显示，模型组肝组织IL-6、IL-1b、TNF-α mRNA的表达量与对照组相比均有不同程度增加(P<0.05)，表明模型组小鼠肝组织中炎症因子大量释放，参与肝纤维化的发生发展。见表1。

2.4肝组织病理形态学变化 肝组织HE染色显示，模型组肝细胞均有不同程度的水肿、颗粒变性及脂肪变性，以3 h及6 h模型组较明显，且可见局灶性坏死、核碎裂及核溶解，并有中性粒细胞浸润。表明缺血再灌注后，肝细胞出现不同程度的损伤，且随时间的增加而加重。见图1。

表1 各组血浆中ALT、LDH、GSH-Px活力及肝组织IL-6、IL-1b、TNF-α mRNA及SOD、MDA水平

图1 各组肝组织形态学(HE染色)

2.5各组肝组织α-SMA mRNA及蛋白表达水平变化 RT-PCR、Western印迹结果显示，与对照组相比，模型组肝组织α-SMA mRNA表达水平和α-SMA蛋白表达量均有不同程度的增加，差异有统计学意义(P<0.05)。基因表达水平与蛋白表达水平趋势一致。提示肝组织中静止的HSC被大量激活，启动和促进肝纤维化的发生发展。见图2、表2。

2.6各组肝组织TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平变化 与对照组相比，模型3 h及6 h组肝组织TGF-β1 mRNA和蛋白的表达量均有不同程度增加，差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1 mRNA水平与蛋白表达水平趋势一致。见表2、图3。

2.7各组肝组织Nrf2 mRNA及HO-1 mRNA表达水平变化 模型组肝组织Nrf2及HO-1 mRNA水平均较对照组下降(P<0.05)。提示缺血再灌注0、3、6 h后，由于氧化应激损伤，Nrf2/HO-1作为内源性抗氧化通路处于抑制状态，氧化还原稳态被打破。见表2。

图2 各组肝组织α-SMA蛋白表达水平变化

表2 各组肝组织α-SMA、TGF-β1、Nrf2、NO-1 mRNA及α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达水平

2.8各组肝组织Smad3、Smad7蛋白表达水平变化 Western印迹检测肝组织缺血再灌注0、3、6 h后与对照组相比，模型组Smad3、Smad7蛋白表达量均有不同程度增加，模型0 h组Smad3、Smad7表达量增加明显(P<0.05)。二者随时间的变化趋势基本一致。见表2、图4。

图3 各组肝组织TGF-β1蛋白表达水平变化

图4 各组肝组织Smad3、Smad7蛋白表达量

3 讨 论

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病共有的一种损伤-修复病理过程，是肝硬化进程的中间环节，多种因素参与其中，包括氧化应激损伤、炎症因子释放等，最终活化HSC促使肝纤维化的发生和发展〔10，11〕。HSC活化是肝纤维化启动的核心事件〔12〕。可见HIRI与肝纤维化是密切关联的两个病理过程。前期研究证实HIRI可以成功介导肝纤维化。TGF-β-Smad通路是致肝纤维化的经典通路之一，而Nrf2/HO-1通路是重要的内源性抗氧化通路。

本研究提示HIRI引起肝组织严重损伤，炎症因子、细胞因子大量释放，氧化应激增强，从而激活肝脏中静止的HSC，活化HSC大量释放细胞外基质，启动肝纤维化，使急性损伤向慢性损伤转化。

在HIRI介导的氧化应激中，氧自由基可以通过蛋白激酶途径使Nrf2磷酸化，激活Nrf2/HO-1通路，进一步上调下游抗氧化酶如SOD、GSH-Px、HO-1的表达，发挥抗氧化作用，维持机体氧化还原平衡〔13〕；但如果氧自由基大量释放则会抑制Nrf2磷酸化，关闭Nrf2/HO-1通路，使其下游抗氧化酶的表达减少，抗氧化能力减弱〔14～16〕。本研究结果提示肝缺血再灌注损伤介导肝纤维化早期阶段，Nrf2/HO-1内源性抗氧化通路被抑制，机体抗氧化能力明显降低，氧化应激增强，活化大量静止HSC，从而启动肝纤维化。

TGF-β1是已知的最为重要的促肝纤维化细胞因子，TGF-β/Smad通路是促肝纤维化最为重要的通路之一〔17〕。TGF-β1在信号传导过程中主要作用的Smad蛋白包括Smad2、3、7，TGF-β1与其受体结合后可激活Smad 2和Smad3 并使其磷酸化，形成异源三聚体复合物易位入核，调控靶基因的表达〔18，19〕；Smad7可与Smad2、Smad3竞争结合TGF-β1型受体，从而阻断Smad2、Smad3磷酸化，发挥负向调控作用，抑制或减弱TGF-β/Smad通路的作用。本研究结果说明肝纤维化启动早期TGF-β1大量分泌后活化了Smad通路，Smad3蛋白的表达水平升高，但是同时Smad7蛋白表达水平也升高，TGF-β/Smad通路作用被削弱，因此在肝纤维启动早期，Smad通路虽然激活了，但可能没有起到主要的致纤维化作用。

综上，肝细胞损伤、炎症因子释放、氧化应激等因素相互促进，互为因果，激活大量静止的HSC，启动肝纤维化的发生。其机制可能与Nrf2/HO-1内源性抗氧化通路被抑制，Smad通路被激活有关，但是Smad通路的激活在HIRI介导肝纤维化的早期启动中可能不起主要作用。