轻度认知障碍患者血浆中差异表达microRNA生物信息学分析

刘艳 于明 徐宇浩

(江苏大学附属医院神经内科，江苏 镇江 212001)

轻度认知障碍(MCI)是介于正常老化和痴呆之间的临界状态〔1〕。研究表明60岁以上的成年人中MCI患病率为6.7%～25.2%，其患病率的增加与年龄的增长及低教育水平高度相关，以男性更为常见〔2〕。据估计，每年有10%～ 15%的MCI患者会发展为阿尔茨海默病(AD)〔3〕。若及早发现和识别MCI阶段，并对其进行积极有效的干预治疗，可改善患者的认知功能，延缓MCI向AD转化。因此，探索MCI早期诊断及预测疾病进展的生物标志物一直是研究者们关注的焦点。

microRNAs是调节神经元和神经胶质细胞功能的关键因子〔4〕。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，生物液体中的microRNA水平分析已经成为一种可行的生物标志物诊断方法。本研究应用生物信息学方法分析和筛选MCI患者血浆中关键的microRNAs，并对关键microRNA的靶基因进行富集分析。

1 材料与方法

1.1基因芯片数据来源 在NCBI(National center for biotechnology information)公共数据平台的GEO(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)数据库搜索框中以“(mild cognitive impairment)AND microRNA”为检索词，选择物种为人类(Homo sapiens)，下载GSE90828基因芯片数据集数据(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE90828)。该数据集是基于GPL22741平台采用(Human PCR panels Ⅰ+Ⅱ，V2)miRCURY LNATMmicroRNA芯片(丹麦Exiqon公司)检测的53例血浆标本，包含来自日本23例MCI患者和30例认知功能正常的老年人的血浆标本。MCI组样本来源于11例男性和12例女性，平均年龄(72.78±6.80)岁；正常对照组样本来源于12例男性和18例女性，平均年龄(70.40±4.51)岁。

1.2差异表达microRNA的筛选和数据处理 利用GEO2R在线分析工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)对GSE90828数据集进行差异表达microRNA分析和筛选，利用Benjamini-Hochberg方法减少错误发现率。设定差异表达microRNA过滤条件为校正后的P值<0.05且|差异倍数(logFC)|≥1.0，其中logFC≥1.0为上调、logFC≤-1.0为下调。运用R(3.6.3版本)语言程序包绘制火山图和差异表达microRNA热图。

1.3差异表达microRNA的靶基因预测 采用TargetScan7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)在线预测工具预测差异表达microRNA的靶基因〔5〕，即通过寻找与microRNA种子序列相匹配的保守的8mer、7mer和6mer位点来预测microRNA的生物学靶点，选择物种为人，并以Cumulative weighted context++ score<-0.4筛选靶基因，该分值越小则靶基因的置信度越高〔6〕。

1.4蛋白质-蛋白质互作网络分析 STRING11.0(https：//string-db.org)是一个常用的蛋白质-蛋白质互作关系的数据库，共存储5 090个物种和2 460万种蛋白质，拥有非常广泛和多样的基准数据来源〔7〕。通过对蛋白质-蛋白质相互作用的可靠性评分，以判定相互作用可靠性的大小。STRING将低可靠性、中等可靠性、高可靠性和最高可靠性的分值分别设置为0.15、0.40、0.70、0.90。本研究中构建编码蛋白相互作用网络(PPI)的筛选条件为中等可靠性的阈值(即Confidence score =0.4)，然后利用Cytoscape3.7.2 软件〔8〕将蛋白质-蛋白质相互作用网络进行可视化，通过CytoHubba插件，对网络中所有节点进行评分，采用最大集团中心度(MCC)算法，筛选前10个关键基因(Hub Genes)。

1.5差异表达microRNA-靶基因相互作用网络构建和关键microRNA筛选 Cytoscape3.7.2 软件构建差异表达microRNA-靶基因相互作用网络，使差异表达microRNA与靶基因的相互作用进行可视化，从而筛选相互作用网络中的关键microRNA。差异表达microRNA靶基因的筛选阈值为cumulative weighted context++ score<-0.4。利用CytoNCA插件度量网络中各节点的中心度(Centrality)值，选择点度中心性(DC)参数，删去DC值<2的节点，进而得到核心网络，依据DC值大小进行排序，筛选核心网络中的关键 microRNA。

1.6关键microRNA靶基因的基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 GO富集分析能够对各物种基因和蛋白质的功能进行规范性描述，按照生物过程、分子功能和细胞组成对基因进行注释和分类。KEGG是1个整合了基因组、化学、健康、系统4大类信息的综合数据库，通过强大的图形功能直观可视化地展现信号途径及各分子间的关系。使用R语言对关键microRNA 的靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。其中GO富集分析以q值Cutoff(校正后的P值临界值)<0.05为筛选条件且显示前10个GO富集分析条目；KEGG富集分析以q值Cutoff<0.05 为筛选条件且显示前30个通路信息。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1血浆差异表达microRNA筛选 基于MCI组与正常对照组的logFC表达和校正后的P值筛选差异表达的microRNA。与正常对照组相比，MCI组血浆中存在14个显著下调microRNAs。显著下调 microRNAs的具体表达情况，见表1、图1、图2。

表1 MCI组患者血浆中显著下调的microRNAs

灰点表示下调的 microRNAs，黑点表示无差异的microRNAs

2.2靶基因相互作用网络图构建及关键基因的筛选 利用STRING 数据库构建的PPI网络图涵盖节点蛋白1 022个、边3 301条，平均节点值为6.46，见图3。利用CytoHubba插件，筛选出前10个关键基因，分别为泛素结合酶(UB)E2D1、转录延伸因(TCE)B1、视网膜母细胞瘤结合蛋白(RBBP)6、泛素蛋白连接酶E3α2(UBR2)、UBE2W、锚蛋白重复序列与SOCS盒蛋白(ASB)6、Cbl原癌基因(CBL)B、环指蛋白(RNF)7、F盒蛋白(FBX)O10和葡萄糖胺(GLMN)，它们是蛋白-蛋白相互作用网络中的关键基因。

2.3差异表达microRNA-靶基因相互作用网络的构建和关键microRNA的筛选 构建差异表达microRNA-靶基因相互作用网络，见图4。利用CytoNCA插件筛选网络中的关键microRNA，DC值居于前4位的microRNAs分别为hsa-miR-27b、hsa-miR-146a、hsa-miR-23a 和has-miR-93*，是调控网络中的关键microRNAs。

2.4关键microRNA靶基因的GO富集分析 hsa-miR-27b主要参与了神经元投射发育的调控、轴突生成、化学突触传递、跨突触信号的调节及额叶发育等生物学过程；hsa-miR-146a主要参与了信号释放、糖蛋白代谢、高尔基囊泡转运及囊泡定位等生物学过程；hsa-miR-23a主要参与了胚胎器官发育、泌尿生殖系统、蛋白激酶活性的激活及间充质细胞分化等生物学过程；hsa-miR-93*主要参与了神经元投射发育的调控、腺体发育、神经递质水平的调节及糖蛋白代谢等生物学过程，见图5。

蓝色代表正常对照组样本，红色代表MCI组样本

圆圈代表蛋白质，直线代表蛋白质间的相互作用；蛋白质中的螺旋表示该蛋白质的结构已知，圆圈内为空表示该蛋白质的结构未知

红色表示 microRNA；绿色表示基因

A：hsa-miR-27b,B：hsa-miR-146a,C：hsa-miR-23a,D：hsa-miR-93*;横坐标为基因比例，圆圈越大表示富集在该GO上的基因数目越多；纵坐标为各分子参与的生物学过程

2.5关键microRNA靶基因的KEGG通路分析 hsa-miR-27b的靶基因主要参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、人鼠肉瘤(Ras)信号通路、ErbB信号通路、轴突导向、蛋白聚糖及调节干细胞多能性等信号通路，hsa-miR-146a的靶基因主要参与1型单纯疱疹病毒感染、卟啉与叶绿素代谢及轴突导向等信号通路，hsa-miR-23a的靶基因主要参与糖胺聚糖的生物合成、轴突导向及转化生长因子(TGF)-β等信号通路，hsa-miR-93*的靶基因主要参与Wnt信号通路、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的耐药性、Hippo信号通路及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)等信号通路，见图6。

A：hsa-miR-27b，B：hsa-miR-146a，C：hsa-miR-23a，D：hsa-miR-93*；横坐标为富集在每个通路上基因的数目，颜色越红表示基因在该通路上富集程度越高；纵坐标为各通路名称

3 讨 论

MCI作为认知障碍的早期阶段，临床表现为认知功能的轻度减退，但日常生活能力不受影响且尚未达到痴呆的诊断标准。Petersen等〔9〕将MCI分为遗忘型MCI(aMCI)和非遗忘型MCI(naMCI)两种类型，并且指出aMCI最易向AD转化。而AD是最常见的神经系统退行性疾病〔10〕，其发病机制主要有β-样淀粉蛋白(Aβ)瀑布学说、Tau蛋白学说、氧化应激学说、细胞周期调节蛋白障碍学说及线粒体功能障碍等，但其具体发病机制尚未完全清楚〔11〕。然而，目前尚没有一种药物被批准用于治疗MCI，同时针对AD发病机制不同靶点的药物开发仍处于试验阶段。

研究已证实突触可塑性在AD的早期发展中起着核心作用〔12〕，因此本研究推测hsa-miR-27b可能通过调节突触传递过程成为MCI的潜在治疗靶点。另外，单胺类神经递质含量与认知功能密切相关〔13〕，而hsa-miR-93*与神经递质水平的调节有关，提示hsa-miR-93*可能通过调节单胺类神经递质的水平，参与MCI向AD的转化过程。本研究结果显示，这些关键microRNA的靶基因主要参与Ras、MAPK、ErbB、TGF-β、Wnt、Hippo和mTOR等信号通路。肾素-血管紧张素系统(RAS)是由肾素、血管紧张素原、血管紧张素转化酶、血管紧张素及相应受体构成，如抑制血管紧张素转换酶或阻断血管紧张素受体可以改善脑血流灌注不足，减少血脑屏障的损伤和神经认知功能的减退，从而发挥神经保护作用〔14，15〕。研究发现MAPK通路可能参与了AD中Tau蛋白的过度磷酸化及淀粉样前体蛋白(APP)的生成过程〔16〕。自噬在神经退行性疾病中起着重要作用，其中mTOR是自噬过程的主要调节因子，受饥饿、生长因子和细胞应激源的调控〔17〕；mTOR可通过抑制自噬过程导致Aβ斑块在脑内积累，进而促进Tau蛋白磷酸化和mTOR的激活过程〔18〕。因此，本研究筛选出的关键 microRNAs，可通过调节这些上述信号通路参与MCI向AD的进展过程。若抑制或增强以上信号通路中某些关键蛋白的表达，可能有助于改善认知功能，从而延缓MCI向AD的转化。

综上，MCI患者血浆中存在14个显著下调的 microRNAs，其中有4个为关键microRNAs，可能成为MCI新的诊断性生物标志物。