RNA甲基化N6-甲基腺苷修饰在眼部疾病中作用的研究进展△

鲍思洁 李鹏飞 康丽华 王从玉 王思文 管怀进

N6-甲基腺苷(m6A)是指在腺嘌呤的第6个N位点上发生的甲基化修饰,是真核生物RNA中最丰富和最保守的转录后修饰[1],主要富集在终止密码子和3’非翻译区(3’UTR)附近,并且只发生在共有基序RRACH(R=A或G;H=A、U或C)序列上[2-3]。m6A修饰过程动态可逆,由三类酶共同协调完成,包括甲基转移酶复合物引入甲基,去甲基化酶去除m6A修饰和m6A识别酶识别发生m6A修饰的信使RNA(mRNA)[4]。研究发现,通过甲基化相关酶干预m6A修饰富集水平不仅能够调节mRNA代谢,包括mRNA选择性剪接、核输出、翻译和稳定性[1],而且参与多种细胞生物学过程,如胚胎发育、免疫调节、生物节律等,进而影响疾病的发生发展过程[5-8]。

1 m6A修饰相关酶

1.1 m6A甲基化酶M6A甲基化酶包括由甲基转移酶样蛋白3(METTL3)和甲基转移酶样蛋白14(METTL14)两个核心成分以及多个调节亚基组成,如Wilm肿瘤相关蛋白(WTAP)、VIRMA、Hakai、RNA结合基序蛋白15(RBM15)、锌指CCCH结构域蛋白13(ZC3H13)和甲基转移酶样蛋白16(METTL16)等共同参与m6A修饰过程[9]。METTL3和METTL14同属S-腺苷-L-蛋氨酸依赖性甲基转移酶超家族,二者可结合形成稳定的METTL3/14复合物。METTL3作为催化核心将甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到腺嘌呤上;而METTL14虽无催化活性,但可作为RNA结合平台促进复合物与RNA结合,增强METTL3催化活性[10]。WTAP可将METTL3/14复合物定位到细胞核的核斑点,进而提高其催化活性[11]。此外,在哺乳动物中,VIRMA、Hakai和RBM15是与WTAP功能相关的辅助调节亚基,通过调节WTAP的可变剪接,参与m6A修饰调控[12],而ZC3H13作为RBM15和WTAP之间的桥梁发挥调控作用[13]。METTL16是近期新发现的调节亚基,可以调控m6A修饰来介导前体mRNA的成熟过程[14]。

1.2 m6A去甲基化酶m6A去甲基化酶,包括肥胖相关蛋白(FTO)和ALKB同源物5(ALKBH5),均属于二价铁/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的ALKB蛋白家族,通过催化目标甲基的羟基化去除m6A修饰[15]。FTO可将m6A氧化成不稳定的N6-羟甲基腺苷和N6-甲酰腺苷(f6A),然后生成正态腺苷酸(A),发挥去甲基化的作用[16]。ALKBH5可将m6A直接转化为A,并通过R130/K132/Y139三联体催化f6A的释放[16]。

1.3 m6A识别酶m6A识别酶根据其与m6A特异性结合的能力分为直接m6A识别酶和间接m6A识别酶。直接m6A识别酶包括YTH结构域家族蛋白(YTHDF1～3和YTHDC1～2),可以通过其C端的YTH结构域识别m6A-RNA直接与之结合而发挥调控作用[17]。此外,还有一种新发现的直接m6A识别酶PRRC2A,通过与共有基序GGm6ACU特异性结合来稳定转录本表达[18]。间接m6A识别酶包括胰岛素样生长因子2结合蛋白(IGF2BP1～3)、异质核核糖核蛋白(HNRNPC/G/a2b1)和真核起始因子3(eIF3)。这些识别酶无法特异性识别m6A修饰,而是被m6A修饰诱导打开自身的RNA结合基序,通过增加对RNA的亲和力来影响RNA蛋白质相互作用发挥调节作用,这种机制被称为“m6A开关”[19]。此外,IGF2BP3除通过GGACU基序直接识别m6A-mRNA以增强mRNA的稳定性外,还通过“m6A开关”机制进行调控[20]。因此,识别酶的作用机制复杂多样,还需要进一步探索和研究。RNA甲基化m6A修饰的研究早期主要集中在肿瘤方面,随着科学技术的进步,其在各种疾病中的生物学功能得到广泛关注。近年来,m6A修饰在眼部疾病中的作用开始受到关注。

2 m6A甲基化与眼表疾病

2.1 真菌性角膜炎真菌性角膜炎是一种由机会性病原真菌感染引起的角膜病变,可严重损害视力,同时,由于糖皮质激素与抗生素的滥用,其发病率持续增加[21-22]。近来,有研究发现,在真菌性角膜炎小鼠模型的病变角膜组织中m6A修饰水平显著升高,经m6A-RNA免疫沉淀(Me-RIP)微阵列杂交分析发现,存在1137个有差异的m6A-mRNA,其中780个显著高甲基化,并且METTL3是介导病变角膜组织mRNA高甲基化修饰的主要修饰酶[23]。京都基因与基因组百科全书(KEGG)结果分析显示,m6A修饰显著升高的mRNA主要富集在磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路,该通路不仅参与微生物的感染和致病过程,在角膜相关疾病中也发挥重要作用[24-25];随后,进一步实验证实,病变角膜组织中的PI3K-Akt信号通路蛋白被激活[24-25]。综上所述,METTL3可能通过上调PI3K-Akt通路mRNA的m6A修饰来激活该通路,进而参与真菌性角膜炎的发病过程。

2.2 翼状胬肉翼状胬肉是从球结膜向角膜侵犯的一种三角形纤维血管赘生物,可覆盖至瞳孔区并严重影响患者视力[26]。Jiang等[27]研究显示,翼状胬肉中的m6A水平较正常结膜组织显著降低,且m6A甲基化酶METTL3表达显著下调;而通过整合m6A-RNA免疫沉淀高通量测序(MeRIP-seq)和RNA高通量测序(RNA-seq)数据发现了87个差异表达的含m6A甲基化差异峰的mRNA。利用生物信息学分析技术从中筛选了与翼状胬肉发育最相关的5个关键基因包括DSP、MXRA5、ARHGAP35、TMEM43和OLFML2A,以及2个信号通路包括Hippo通路、Notch通路;进一步研究发现,METTL3下调导致的m6A修饰水平降低可能是翼状胬肉发生发展的一个重要原因,虽然利用生物信息学分析了潜在下游靶标和信号通路,但具体机制仍待进一步研究证实。

2.3 角膜损伤众所周知,角膜缘干细胞对于维持角膜再生和损伤修复具有重要意义[28],有研究发现,m6A甲基化可以调控角膜干细胞的分化,METTL3发挥关键m6A修饰调控作用[29]。首先,利用角膜缘干细胞METTL3特异性条件敲除小鼠建立碱烧伤模型,观察到METTL3敲除小鼠的角膜损伤修复能力明显增强。进一步联合高通量测序与生物信息学分析发现,神经母细胞分化相关蛋白(ANHAK)和DNA损伤诱导转录因子4样蛋白(DDIT4)是METTL3的下游靶标。抑制ANHAK表达可以上调内源性c-Myc从而诱导角膜多能干细胞的产生[30];而DDIT4与间充质干细胞的分化潜能直接相关[31]。综上所述,METTL3可能通过调节AHNAK和DDIT4的m6A修饰水平干预其表达,从而影响角膜缘干细胞的增殖、分化和迁移来参与角膜损伤修复。

3 m6A甲基化与青光眼

青光眼是由视网膜神经节细胞(RGCs)功能异常导致的以进行性视力丧失为特征的神经退行性疾病,维持RGCs树突分支结构对延缓青光眼引发的RGCs退行性病变具有重要意义[32]。Niu等[33]观察到发育小鼠的RGCs呈现m6A修饰高水平表达,且m6A识别酶YTHDF2在RGCs中高表达,敲除YTHDF2可显著增加RGCs树突分支,改善小鼠视力,同时减轻急性高眼压导致的RGCs树突收缩和神经元损失。进一步研究揭示,YTHDF2可通过下调热休克蛋白A12A(HSPA12A)和免疫球蛋白超家族富含亮氨酸重复蛋白2(ISLR2)的表达,负向调节RGCs树突的分支形成和结构维持[33]。因此,YTHDF2在青光眼中可能具有视网膜毒性作用。此外,Liu等[34]通过兔青光眼滤过术(GFS)模型证明,METTL3/m6A-Smad3轴的激活可导致细胞外基质异常积累、Tenon囊成纤维细胞过度增殖,进而导致患者术后瘢痕形成。因此,m6A甲基化可以作为降低GFS术后瘢痕形成的新靶点。

4 m6A甲基化与白内障

白内障是全球主要的致盲性眼病,给家庭和社会造成了巨大的经济负担[35]。因此,白内障发病机制的防治研究具有重要意义。近年来,探讨m6A修饰在白内障形成过程中的作用机制成为新兴研究热点。

4.1 年龄相关性白内障年龄相关性白内障(ARC)是白内障中最常见的类型,包括皮质型白内障(ARCC)、核型白内障和后囊下白内障,其中ARCC最为多见。Li等[36]采用MeRIP-seq技术探究了ARCC患者的晶状体上皮细胞中(LECs)环状RNAs(circRNAs)的m6A修饰组学,结果发现,ARCC中,circRNAs的总m6A丰度较对照组显著降低,同时m6A修饰高度富集的circRNAs表达水平明显降低;随后对m6A相关酶进行筛选发现,甲基转移酶(METTL14、WTAP)及去甲基化酶ALKBH5的mRNA表达均显著上调,而FTO基因和METTL3基因表达未见显著变化;进一步结合差异m6A-circRNAs和差异表达circRNAs的数据发现,m6A-circRNAs与DNA损伤修复和自噬通路密切有关。综上所述,在ARCC的LECs中,ALKBH5表达上调可能改变晶状体基因组的m6A修饰图谱,同时,m6A-circRNAs可能调节DNA损伤修复和自噬相关基因的表达来参与ARCC的发生发展过程。

4.2 糖尿病性白内障糖尿病性白内障(DC)由糖尿病引起,高葡萄糖(HG)引起的LECs凋亡和代谢紊乱是DC重要的发病机制[37]。因此,为了深入探讨DC的发病机制,Yang等[38]利用MeRIP-Seq技术在HG诱导DC体外细胞模型中揭示了m6A-mRNA修饰图谱,并且在DC组织和HG诱导的体外细胞模型中,m6A修饰水平升高主要与METTL3表达上调有关,敲除METTL3可逆转HG诱导的LECs凋亡。进一步MeRIP-PCR实验也证实了细胞间黏附因子-1(ICAM-1)是METTL3发挥功能调控的下游靶基因。综上,上调的METTL3可能通过增加ICAM-1 mRNA 3’UTR的m6A修饰来稳定其蛋白表达水平,从而促进HG诱导的LECs凋亡,导致DC的发生。

4.3 高度近视白内障高度近视指近视超过6.00 D或者眼轴长度≥26 mm,是核型白内障早发的重要危险因素[39]。此前,有研究证实,DNA甲基化修饰介导的抗氧化基因表达下调能够导致高度近视白内障(HMC)的发生[40]。近期,有研究探讨了RNA甲基化m6A修饰在HMC中的作用机制[41-42]。首先,该团队利用MeRIP-seq技术检测并对比了HMC与ARC患者LECs中全转录组的m6A修饰位点,结果发现,HMC中,m6A修饰的峰数量显著增加,并且主要富集在3’UTR、编码序列起始密码子和终止密码子附近。同时,还检测到METTL14表达上调,而METTL3和FTO、ALKBH5表达下调。后续研究发现,COL6A3、CHI3L1、PXDN为潜在下游靶标,其中,CHI3L1编码的YKL-40蛋白在细胞增殖、迁移、分化和组织重塑中发挥重要作用。总的来说, METTL14、FTO和ALKBH5三者联合调控CHI3L1的m6A修饰水平,进而影响YKL-40蛋白的功能表达,严重影响细胞外基质的组成从而导致HMC的发生。

5 m6A甲基化与视网膜疾病

5.1 缺氧导致的视网膜新生血管性疾病缺氧引起的视网膜病理性血管生成是多种视网膜血管疾病的重要病理基础[43]。研究发现,无论是在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)离体模型中,还是在小鼠中,缺氧均可引起m6A水平升高和METTL3表达升高[44]。在上述两种模型中敲除METTL3后发现,METTL3可在体外促进HUVECs活力、增殖和迁移,并在体内促进视网膜新生血管形成;另外,Wnt信号通路成员LRP6和DVL1是METTL3的下游靶标。METTL3可以增加LRP6和DVL1的m6A修饰水平,并依赖YTHDF1促进其翻译,从而参与病理性血管生成。因此,通过调节m6A甲基化干预血管稳态对预防病理性血管生成具有重要意义。

5.2 糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的微血管并发症,其特征是视网膜血管生成、渗漏和缺血,严重危害人类健康[45]。目前,m6A甲基化可以从多个机制参与DR的发生发展。视网膜血管周细胞可维持血管稳定性,其功能障碍是DR早期阶段的病理标志[46]。研究发现,在体外HG诱导的周细胞和DR小鼠模型的视网膜血管中,METTL3表达上调可增加下游PKC-η、FAT4和PDGFRA mRNA的m6A修饰,并依赖YTHDF2促进其降解,从而导致周细胞功能障碍和视网膜血管并发症[47]。因此,抑制METTL3依赖的m6A甲基化可预防DR进展。此外,还有研究通过微阵列分析发现,赖氨酸乙酰转移酶1(KAT1)在糖尿病小鼠视网膜组织中表达显著下调,而KAT1表达上调可以乙酰化修饰YTHDF2启动子,激活其转录活性,进而促使m6A-ITGB1 mRNA降解,抑制视网膜Müller细胞和微血管内皮细活力以及新生血管形成,进而加速了DR进展[48]。也有研究从炎症机制的角度对DR进行探究,结果发现,在HG处理的小胶质细胞中,ALKBH5可通过下调抗炎因子A20的m6A修饰参与调控小胶质细胞的炎症过程,进而延缓DR进展[49]。这些研究揭示了m6A修饰在DR中的关键作用,为DR的发病机制和临床干预提供了新见解。

5.3 视网膜色素变性视网膜色素变性(RP)是一种遗传性、营养不良性视网膜退行性变,与视网膜色素上皮(RPE)结构和功能异常导致的光感受器细胞凋亡和坏死有关[50-51]。Yin等[52]研究发现,METTL14可上调m6A修饰,并依赖YTHDF2抑制微管相关蛋白2(MAP2)的表达减少,其与RP致病基因NEUROD1直接相互作用以维持RPE的紧密连接,抑制其凋亡,最终延缓RP的进展。这些发现显示,METTL14/YTHDF2/MAP2/NEUROD1轴可作为RP的有效治疗策略。

6 m6A甲基化与葡萄膜疾病

6.1 葡萄膜炎葡萄膜炎是一种累及虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜及其血管的炎症性疾病。流行病学统计显示,约25%的不可逆失明是由葡萄膜炎及其并发症引起的[53]。Zhou等[54]在葡萄膜炎小鼠模型和细胞炎症模型中发现,m6A识别酶YTHDC1在视网膜小胶质细胞中的表达下调,敲除YTHDC1可明显抑制促炎表型(M1型)小胶质细胞极化和迁移。M1型小胶质细胞可产生促炎细胞因子诱发视网膜炎症反应,同时,随着它的迁移,炎症细胞被募集到视网膜,进一步加剧视网膜炎症反应,导致葡萄膜炎恶化[55-57]。此外,有研究发现,具有抑制小胶质细胞炎症作用的沉默信息调节因子1(SIRT1)是YTHDC1的下游靶标[58]。总的来说,抑制YTHDC1可使m6A-SIRT1稳定性降低且表达下调,从而激活M1型小胶质细胞进而加剧炎症反应。该研究首次阐明了YTHDC1在M1型小胶质细胞激活中的关键作用,通过介导m6A-SIRT1表达参与葡萄膜炎的炎症过程。

6.2 m6A甲基化与Graves眼病Graves眼病(GO)作为Graves病患者最重要的甲状腺外表现,是一种主要累及眼眶脂肪组织及眼外肌(EOMs)的慢性炎症性疾病,可导致眼动和眼睑闭合障碍、视神经压迫,甚至视力丧失[59]。Zhu等[60]研究发现,在GO患者的EOMs中表达上调的WTAP基因可上调m6A修饰水平,进而通过激活的免疫反应和炎症反应相关基因与信号通路,增加IL-6、IFN-γ和TNF-α等细胞因子表达以促进EOMs中成纤维细胞增殖分化,从而参与GO进展[61],该研究提示,m6A修饰在全身疾病相关的眼部病变中也具有重要的调控作用,为进一步探究全身疾病相关眼部病变的发病机制提供了新思路。

7 m6A甲基化与眼部肿瘤

7.1 眼部黑色素瘤眼部黑色素瘤(OM),包括葡萄膜黑色素瘤(UM)和结膜黑色素瘤(CM),是成人最常见的原发性眼部肿瘤,复发率高,预后差[62]。一项关于m6A甲基化与UM的生物信息学研究表明,m6A修饰相关酶的表达与UM的预后和恶性程度密切相关[63]。Jia等[64]在人OM样本中验证了m6A修饰丰度较正常对照样本显著降低,同时发现,其主要受到METTL3和ALKBH5的调控。随后经Me-RIP-seq和RNA-seq确定了下游靶标为HINT2基因,并且m6A-HINT2 mRNA依赖于YTHDF1的调控促进肿瘤抑制因子HINT2的翻译,达到抑制OM生长和迁移的作用。此外,Hao等[65]研究证实,ALKBH5通过发挥去甲基化酶活性降低叉头框转录因子M1(FOXM1) mRNA的m6A修饰水平,增加其稳定性以上调其表达,进而增加肿瘤细胞迁移、侵袭以及诱导肿瘤间质-上皮转化,促进UM进展。类似的,Yu等[66]研究发现,YTHDF2在OM中可充当癌基因,可被H3K18la激活发生组蛋白乳酸化促进转录增加,进而通过与PER1和TP53的m6A位点结合促进其降解导致OM的发生。然而,也有研究表明,在UM中上调的METTL3通过靶向c-Met参与Akt信号通路,促进细胞周期相关蛋白表达以促进UM的增殖、迁移和侵袭过程[67]。He等[68]研究也发现,上调的m6A修饰BACE2/TMEM38B轴触发细胞内钙释放加速了OM的发生。总之,m6A修饰与眼部黑色素瘤的发生发展密切相关,有望成为OM分子治疗新的潜在靶点。

7.2 视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤(RB)是儿童期最常见的原发性眼内恶性肿瘤,目前普遍认为由抑癌基因RB1的2个等位基因突变引起,具有高度侵袭性,严重危害患儿的生命安全[69-70]。Zhang等[71]研究发现,上调METTL3可通过激活PI3K/Akt/mTOR /P70S6K/4EBP1信号通路促进RB细胞的增殖、迁移和侵袭,而低表达METTL3可明显抑制RB细胞的生物行为。该研究为m6A甲基化修饰在RB进展中提供了新见解,并为治疗RB提供新的分子靶标。

8 结束语

本文主要阐述了RNA甲基化m6A修饰对眼部疾病的调控,包括眼表疾病、白内障、青光眼、葡萄膜炎、视网膜疾病和眼部肿瘤疾病,但是否参与其他眼部疾病的调控仍有待进一步研究。现有研究提示,m6A可作为肿瘤治疗的切入点控制癌症进展,在治疗中发挥重要作用,虽然目前尚无m6A甲基转移酶抑制剂,但FTO抑制剂已在体外和癌症动物模型中显示出有希望的抗癌作用。因此,随着对眼部疾病发病机制以及m6A修饰靶向治疗的深入研究,m6A修饰也有望成为治疗眼部相关疾病的新靶点,为眼部疾病的防治提供新思路。