新生儿缺氧缺血性脑病血清miR-384与炎症反应、神经行为的相关分析

王 彤，杨国颖，赵凯红，邢 烨，田 勃

(唐山市妇幼保健院新生儿科，河北 唐山 063000)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)主要因围产期窒息所致，发病机制较复杂，既往研究指出其可能与炎性细胞因子有关，同时氧自由基增加、脂质过氧化等可能共同参与了HIE进展，能诱发脑水肿、神经元坏死等病理改变，促进神经纤维性质改变[1]。HIE症状包括抽搐、意识状态改变、原始反射异常等，患儿死亡率较高，预后欠佳，部分患儿还会出现不同程度的后遗症，例如智力低下、癫痫、脑瘫等[2]。因此，临床需进一步探究HIE的发生与进展机制，以期为该病治疗提供依据。

目前，有学者指出微小分子核糖核酸(microRNA，miR)与多脏器损伤有关，当脏器处于缺氧、缺血状态时能促进炎症因子分泌，将特定信号路径激活，上调相关基因表达，促进细胞坏死，miR可能参与了相关基因的调控过程[3]。动物实验发现miR-384-5p(从miR-384前体的5′端臂加工而成)表达与大鼠神经细胞凋亡有关，在大鼠皮质受损后可见miR-384-5p表达下调[4]，提示miR-384可能在脑神经病变中有调节作用。另有研究认为miR-384表达下调可能通过敲除环状RNA染色质重塑因子(Circular RNA bromodomain PHD finger transcription factor，circBPTF)对机体炎症免疫进行调节，使高糖诱导的免疫炎症紊乱改善，缓解应激反应[5]。而炎症与HIE进展密切相关，当脑中枢组织受到损害时，可引起固有免疫系统受损，致大量炎症介质释放，加重HIE患儿的脑组织损害[6]，但目前针对miR-384是否通过调节炎症免疫影响HIE患儿的病情尚无定论。动物实验提示HIE与免疫功能异常有关，窒息缺氧能引起T细胞亚群异常，导致淋巴细胞凋亡加速及辅助性T细胞17/调节性T细胞(helper T cell 17/regulatory T cell，Th17/Treg)失衡，诱发免疫功能紊乱，提示Th17/Treg失衡可能在HIE中发挥了调节作用[7]。而目前尚不明确miR-384与Th17/Treg平衡及HIE之间的关系，基于此，本次研究纳入106例HIE新生儿进行研究，分析其miR-384表达水平与炎症反应、Th17/Treg失衡、神经行为的相关性，以期为HIE临床治疗提供思路，报道如下。

1对象与方法

1.1研究对象

选择2015年10月至2020年10月唐山市妇幼保健院收治的106例HIE患儿为HIE组，另选取同期同院产科分娩的90例健康新生儿为对照组。HIE诊断标准：参考《新生儿缺氧缺血性脑病.第2版》[8]：①孕妇既往有可能引起胎儿宫内窘迫的产科病史，且伴有胎儿宫内窘迫症状(例如羊水Ⅲ度污染，胎心<100次/min，且持续时间≥5min)或者在分娩过程中有明显窒息史；②出生时存在重度窒息，即1min Apgar评分≤3分，延续至5min Apgar评分仍≤5分，或者脐动脉血气PH≤7.00；③新生儿出生后发生意识改变、原始反射异常、肌张力改变等神经系统异常表现，持续时间>24h；④排除其他原因(如产伤、颅内出血等)所致的抽搐及宫内感染、遗传代谢性疾病和其他先天性疾病所引起的脑损伤，满足上述4条则可确诊。纳入标准：①HIE组：符合上述诊断标准者；未见先天遗传性疾病者；胎龄37～42周者；患儿监护人对研究内容知情同意。②对照组：同期于我院产科分娩的健康新生儿；胎龄37～42周者；孕妇孕期健康；Apgar评分为8～10分者；患儿监护人对研究内容知情同意。排除标准：因遗传代谢性疾病或其他先天疾病所致的脑损伤者；先天畸形者；颅内出血者；孕妇有妊娠期糖尿病、妊娠期高血压等合并症；机体严重感染者；脑结构发育异常者。研究方案获医院伦理委员会批准。

1.2检测方法

1.2.1炎症因子、Treg、Th17及其他细胞因子检测

两组新生儿采集4mL外周血，分装于两管。其中一管血样离心10min，转速3 000r/min，分离血清，存至-70℃环境待测。经酶联免疫吸附法检测血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司，经霍尔德HED-SY96S自动酶标仪(山东霍尔德电子科技有限公司)测定；另一管血样加入抗凝剂，存至-70℃环境待测，经贝克曼库尔特DxFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)测定Treg、Th17水平，计算Th17/Treg值。

1.2.2血清miR-384检测

另取2mL外周血，离心方式同上，取血清存至-70℃环境待测。经实时逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测miR-384。主要试剂为总RNA提取试剂、逆转录试剂、qPCR试剂、异丙醇、氯仿，均由赛默飞世尔科技公司提供。主要仪器为TG-16W高速离心机[爱来宝(济南)医疗科技有限公司]、KS48+型PCR扩增仪[冠森生物科技(上海)有限公司]、F3微量移液器(赛默飞世尔科技公司)。具体如下：严格根据试剂说明书提取总RNA，待提取完毕，取RNA液体2μL测定纯度，分析A260/A280值，若二者比值在1.6～1.9之间，则提示纯度满足检测要求。针对总RNA液体进行逆转录，使其合成cDNA，将cDNA产物冷却，并行PCR扩增，反应条件如下：95℃预变性30s；95℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40个循环。引物序列为①miR-384：上游5′-GCCGAGATTCCTAGAAATTG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；②内参引物U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。利用2-△△CT表示miR-384表达水平，取3次试验均值为最终结果。

1.3 HIE分组与评价标准

根据HIE分度标准将患儿分成轻度组(n=37)、中度组(n=44)、重度组(n=25)。HIE分度标准[8]①轻度：意识处于兴奋与抑制交替的状态，肌张力稍微增高或者正常，拥抱反射良好，吸吮反射正常，可能伴有肌阵痉挛，未见中枢性呼吸衰竭，瞳孔扩大或正常；②中度：嗜睡，肌张力有所下降，拥抱、吸吮反射减弱，常有惊厥，伴有中枢性呼吸衰竭，瞳孔常缩小；③重度：昏迷，肌张力松软，拥抱、吸吮反射消失，持续惊厥，伴明显中枢性呼吸衰竭，瞳孔扩大，对光反射延迟。

新生儿神经行为量表(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)评分[9]：包括原始反射(3项)、行为能力(6项)、一般反应(3项)、主动肌张力(4项)与被动肌张力(4项)5个维度，共20个条目，每项计0～2分，总分范围为0～40分，总分35分以下提示神经功能异常，分值越高表明神经功能越好。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组基线资料比较

两组性别、胎龄、新生儿出生体重及分娩方式比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2两组血清miR-384、炎症因子及NBNA评分比较

HIE组血清miR-384水平及NBNA评分低于对照组，IL-6、CRP、TNF-α水平高于对照组，差异均有统计学意义(t值介于-21.533～30.802之间，P<0.05)，见表2。

表2 两组血清miR-384、炎症因子及NBNA评分比较

2.3两组Th17、Treg及Th17/Treg比较

HIE组Treg水平低于对照组，Th17、Th17/Treg水平高于对照组，差异均有统计学意义(t值介于-6.166～8.390之间，P<0.05)，见表3。

表3 两组Th17、Treg及Th17/Treg比较

2.4不同临床分度HIE患儿血清miR-384、炎症因子及NBNA评分比较

HIE轻、中、重度组血清miR-384水平及NBNA评分均依次降低，IL-6、CRP、TNF-α水平均依次升高，差异有统计学意义(F值介于82.368～225.418之间，P<0.05)，见表4。

表4 不同临床分度HIE患儿血清miR-384、炎症因子及NBNA评分比较

2.5不同临床分度HIE患儿Th17、Treg及Th17/Treg比较

HIE轻、中、重度组Treg依次降低，Th17、Th17/Treg均依次升高，差异有统计学意义(F值介于135.487～513.891之间，P<0.05)，见表5。

表5 不同临床分度HIE患儿Th17、Treg及Th17/Treg比较

2.6 HIE患儿miR-384与炎症因子、Th17、Treg、NBNA评分的相关性

经Pearson线性相关分析提示，HIE患儿血清miR-384与IL-6、CRP、TNF-α、Th17、Th17/Treg呈负相关(r值介于-0.867～-0.406之间，P<0.05)，与Treg、NBNA评分呈正相关(r值分别为0.671、0.776，P<0.05)，见表6。

表6 HIE患儿miR-384与炎症因子、Th17、Treg、NBNA评分的相关性

3讨论

3.1 HIE发病现状及基础机制分析

研究表明在我国活产儿中，约3‰～6‰出现HIE，死亡率约为15%～20%，即便患儿存活，仍有约25%～30%发生不同程度的神经系统后遗症[10]。尽早对患儿进行治疗，可以改善其预后。研究指出免疫炎症反应参与了HIE发病与进展过程，炎症因子可通过炎症细胞、免疫细胞产生，对细胞功能有调节作用；促炎因子的过度释放能启动炎症机制，扩大炎症反应，加重HIE所致的神经损害[11]。Th17/Treg失衡也与HIE有关，二者失衡通常表现为与之相关的促炎因子释放增加，而抗炎因子释放减少，引起炎症免疫紊乱，促使脑组织功能损害[12]。有学者发现某些miRNA在组织处于缺氧、缺血时存在异常表达，miRNA的转录水平对蛋白功能有一定影响，参与其凋亡、生长等过程，它通过对基因转录后沉默进行介导，从而在HIE中发挥作用[13]。临床通过分析相关的miRNA在HIE中的作用，可能对该病治疗具有一定指导意义。

3.2 HIE与炎症因子、miR-384表达、Th17/Treg失衡的关系

本研究提示与健康新生儿相比，HIE患儿的血清IL-6、CRP、TNF-α水平明显增高，而NBNA评分下降，表明患儿存在炎症反应，且神经行为能力相对较差。IL-6是一种促炎因子，在中枢神经系统防御、损害过程中发挥了重要的调节作用，在出现HIE后可导致IL-6水平迅速上调，它能促使炎症细胞在病变部位大量聚集，促进中性粒细胞释放大量的毒性氧基，加重HIE损害[14]。CRP、TNF-α对炎症介质释放有激活作用，能促进局部炎症损害，且对黏附因子释放、合成存在诱导作用，致脑损害加重[15-16]。

本研究结果显示HIE患儿的血清miR-384表达量较正常新生儿明显降低。目前，动物研究发现在中枢神经功能损伤后，海马体中miR-384-5p存在异常表达[17]，表明其可能参与了中枢神经毒性进展，与脑损害发生存在关联。Liu等[18]认为miR-384对脑中枢神经元的调节机制比较复杂，可能通过Snhg8/miR-384/Hoxa13/FAM3A轴发挥作用，其中Snhg8过表达能调控miR-384发挥抗细胞凋亡作用，而miR-384表达能靶向其3′UTR影响Hoxa13表达，Hoxa13则能与FAM3A启动子结合，对神经元凋亡进行调节，但在该调节轴中，miR-384过表达反而促进神经元凋亡，加重脑损害，与本次结论相悖。分析原因可能为上述研究以小鼠为模型，而本研究以新生儿为研究对象。miR-384还可能通过减少脑组织内炎性巨噬细胞，从而减少脑内丙二醛、过氧化氢酶和超氧阴离子阳性细胞数量，减轻局部炎症，对脑组织进行保护[19]。而炎症与HIE发生密切相关，大量炎症介质的释放会加重HIE严重程度，miR-384低表达则可能通过促炎作用，加速HIE发生与进展。

本研究发现HIE患儿的血清Treg下降，Th17、Th17/Treg增高，表明Th17/Treg参与了该病发生过程。Treg具有抗炎功能，能对自身免疫反应进行抑制，在限制炎症、维持免疫稳定性中发挥重要作用。Th17则具有促炎作用，它能通过调节核转录因子-kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)信号路径，促进炎症介质产生。脑损伤患者可见Th17/Treg失衡，具体表现为Th17及其细胞因子含量上升，而Treg及其细胞因子含量下降，Th17/Treg失衡可通过调节相关的炎症信号通路，促进脑损伤[20]。

3.3 miR-38表达与HIE患儿炎症、Th17/Treg失衡、NBNA评分的关系

本研究显示随着HIE临床分度增加，患儿的促炎因子表达水平逐渐升高，而血清miR-384水平、抗炎因子表达水平逐渐下降，且NBNA评分逐渐降低。这表明HIE患儿病情加重与炎症反应程度及神经行为能力水平有关。患儿机体组织中的炎症程度越重，则可导致脑损害进一步加剧，进而影响神经行为功能，经之前的分析提示血清miR-384在脑损伤中能发挥抗炎作用，而低表达的miR-384可能无法对脑内炎性巨噬细胞进行充分调节，促进神经炎症，加重中枢神经毒性，致脑损害进展，上述作用可能共同导致HIE病情加重。本研究提示HIE患儿血清miR-384与炎症因子、Th17、Treg、NBNA评分均有相关性，这进一步提示miR-384可能通过与炎症因子、Th17、Treg相互作用，参与HIE进展。miR-384可能通过减少炎性巨噬细胞、下调促炎介质水平发挥抗炎功能，对脑组织功能进行保护，而一旦miR-384表达下调，则可能致炎性巨噬细胞数量增加，促炎介质释放增多，导致与Th17相关的促炎因子大量释放，机体抗炎作用减弱，Treg相关抗炎因子水平下调，促使Th17/Treg失衡。

综上所述，HIE患儿血清miR-384水平下调，且其可能与炎症因子、Th17、Treg共同影响HIE患儿病情有关，临床有望通过检测血清miR-384水平辅助评估HIE患儿病情。本研究局限性为受研究时间限制，未进一步随访观察miR-384对HIE患儿远期脑发育是否有影响，日后将增设随访对此予以探讨。