金蓉颗粒通过雌二醇/活性氧簇/核转录因子E2相关因子2通路抑制乳腺癌进程的机制研究

李东梅， 陈青青， 陈丹丹， 韦任雄， 周若鹏， 林毅， 陈前军

（1.广东省中医院珠海医院，广东珠海 519000；2.广东省中医院，广东广州 510120；3.普宁市中医院，广东揭阳 515343；4.广州奇绩医药科技有限公司，广东广州 510663）

女性乳腺癌已超过肺癌，成为全球癌症发病率第一的癌症，同时为全球第五大癌症死亡原因[1]。预防乳腺癌转移，降低其死亡率，是一项世界范围的重要研究课题。研究表明，长期暴露于雌激素会增加乳腺癌变的几率[2]，活性氧簇（ROS）在肿瘤进展中发挥着重要作用，调控细胞生长、凋亡与癌变[3-4]。转录因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞防御氧化应激的核心调节因子，可激活抗氧化剂反应元件，上调抗氧化酶和肽的表达，促进内源性抗氧化剂的生成，提高细胞抗氧化应激能力[5]，在肿瘤活性代谢物异常或氧化应激损伤时发挥保护作用，预防肿瘤细胞的发生、转移[6-11]。因此，激活ROS/Nrf2通路是抑制肿瘤生长与转移的重要思路和潜在靶点[12-15]。

乳腺癌归属于中医学“乳岩”“乳石痈”等范畴，肝气郁结、冲任失调是乳腺癌发生发展的重要病机[16-18]。研究[19-20]表明，冲任失调与雌激素分泌及代谢紊乱密切相关。金蓉颗粒为中药复方制剂，是国医大师林毅教授在消癖口服液系列的基础上研制而成，由淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、制何首乌、女贞子、鳖甲、牡蛎等组成，具有调摄冲任、疏肝解郁之功效。既往研究发现，消癖口服液系列可逆转乳腺的不典型增生，同时对雌激素亦有良好的调节作用[21-24]。因此，本研究从雌二醇（E2）/ROS/Nrf2通路角度出发，观察金蓉颗粒对乳腺癌发展的抑制作用及机制，以期为其临床应用治疗乳腺癌提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 12只SPF级雌性MMTV-PyMT小鼠，3～4周龄，体质量20～25 g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0085。本实验在广东省中医药工程技术研究院动物实验室完成，SPF饲养环境及饲料均符合国家标准。本实验方案已获得广东省中医院实验动物伦理委员会审查通过（批准号：2018031）。

1.2 试剂与仪器 过氧化氢酶（CAT）活性、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）以及雌二醇（E2）等检测试剂盒，均购自南京建成生物公司；活性氧簇（ROS）检测试剂盒（泉州九邦生物公司）；兔抗Nrf2抗体、兔抗血红素加氧酶1（HO-1）抗体、兔抗NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO1）抗体以及层黏连蛋白（Laminin）抗体，均购自于美国Cell Signaling Technology（CST）公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（美国Beyotime公司）；Nrf2、HO-1、NQO1及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的上下游引物均由广州市锐博生物科技有限公司合成。倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；1-15K冷冻台式离心机（德国Sigma公司）；高速匀浆仪（德国Eppendorf公司）。

1.3 药物及制备 金蓉颗粒（原名“消癖颗粒”），购自广州奇绩医药科技有限公司，批号：18090103，国药准字Z20180002。60℃水浴，用生理盐水充分溶解金蓉颗粒，制备成浓度12.5μg/μL，置于4℃冰箱中存储。

1.4 实验分组与干预 12只MMTV-PyMT小鼠被随机分成2组，即模型组和金蓉颗粒组，每组6只。第4周开始药物干预。金蓉颗粒组：给予0.5 mg·kg-1·d-1金蓉颗粒混悬液灌胃，小鼠给药量基于前期研究[25]基础，由成人临床等效剂量计算所得；模型组：给予等体积生理盐水灌胃。共给药12周。实验第9周和第15周（即给药后第5、12周）后，每组随机取3只小鼠取材。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 小鼠状态监测 每天记录2组MMTV-PyMT小鼠的饮食及毛发光泽等状态。从第29天至第84天，每2 d称量小鼠体质量。

1.5.2 标本的处理与观察 治疗结束后取材。麻醉后眼眶取血，收集血清存储于-80℃冰箱。取出2组小鼠乳腺肿瘤组织和双肺，记录每组乳腺肿瘤数，称量瘤体，将瘤体置于A4纸上拍照，记录肺内转移灶。最后将乳腺肿瘤组织、肺组织均分后分别置于液氮和10%多聚甲醛中储存。

1.5.3 血清生化指标检测 取出2组血清样品，冰上或4℃融化，采用ELISA法检测小鼠血清中E2、8-OHdG、SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC、ROS水平，具体步骤按说明书进行操作。

1.5.4 苏木素-伊红（HE）染色法观察乳腺肿瘤组织、肺组织形态学变化 固定过的乳腺肿瘤组织、肺组织经脱水、透明、浸蜡和包埋后，将样本制成4μm厚切片。常规HE染色后，比较2组乳腺肿瘤组织细胞形态、核大小，肺内转移灶等情况，评估金蓉颗粒的疗效。

1.5.5 免疫组织化学法检测乳腺肿瘤组织中HO-1、Nrf2、NQO1和Laminin的表达水平 将各组乳腺肿瘤组织蜡块进行石蜡切片，切取5μm厚的薄片，经过常规的脱蜡、脱水和抗原热修复，山羊血清37℃封闭30 min，然后滴加Nrf2（1∶50）、HO-1（1∶200）、NQO1（1∶200）及Laminin（1∶500）一抗，4℃冰箱孵育过夜。PBS清洗3次后滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶1 000），37℃孵育30 min，PBS冲洗3次。先滴加100μLDAB进行显色5 min，后用苏木素复染3 min，水冲洗至返蓝。将切片置于70%～100%乙醇梯度脱水后二甲苯透片晾干，中性树胶封片同时避免气泡，自然晾干后拍照。以棕褐色染色为阳性表达。Nrf2阳性染色定位于细胞质和细胞核，HO-1阳性染色定位于内质网，NQO1阳性染色定位于细胞质及Laminin阳性染色定位于细胞外基质中。使用ImageJ软件对每张切片3个不同的视野进行分析。以平均光密度（AOD=IODSUM/Area SUM）值用于量化HO-1、Nrf2、NQO1和Laminin的表达。

1.5.6 qRT-PCR法检测Nrf2、HO-1及NQO1mRNA表达水平 TRIzol法提取乳腺肿瘤组织总RNA。应用一步法反转录试剂盒转录成cDNA并进行PCR扩增，反应体系25μL。引物序列如表1所示，采用SYBR Green I荧光染料法进行PCR实验。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸34 s，变性到延伸进行40个循环，以GAPDH为内参，检测各组Ct值。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示。当2组数据满足正态性及方差齐时，采用t检验；当不满足正态性或方差不齐时，选用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金蓉颗粒对MMTV-PyMT小鼠体质量、肿瘤生长的影响 实验第29～84天监测2组小鼠体质量变化，结果显示，2组小鼠体质量均稳定增长，2组增长趋势几乎一致，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 2组MMTV-PyMT小鼠体质量比较Figure 1 Comparison of body mass between the two groups of MMTV-PyMT mice

第9周后取材时，模型组有3只小鼠可见乳腺自发肿瘤，金蓉颗粒组有3只小鼠未见瘤变；第15周后取材时，模型组和金蓉颗粒组小鼠均可见乳腺肿瘤。表2结果显示，金蓉颗粒组乳腺的肿瘤数目低于模型组，表明金蓉颗粒可延缓MMTVPyMT小鼠瘤变的形成。图2结果显示：金蓉颗粒组瘤体体积为（5.90±0.77）mm3，低于模型组（12.05±1.83）mm3，差异有统计学意义（P=0.001）；金蓉颗粒组瘤体质量为（0.04±0.03）g，低于模型组（0.18±0.05）g，差异有统计学意义（P=0.003）。提示金蓉颗粒可抑制乳腺肿瘤进展。

图2 2组MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤体积、质量比较Figure 2 Comparison of breast tumor volume and mass between the two groups of MMTV-PyMT mice

表2 2组MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤数目比较Table 2 Comparison of the number of breast tumor between the two groups of MMTV-PyMT mice

2.2 金蓉颗粒对MMTV-PyMT小鼠体内血清生化指标的影响 图3结果显示：实验第9周后，金蓉颗粒组小鼠体内E2和DNA氧化损伤生物标记物8-OHdG水平均有所降低，但与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；第15周后，金蓉颗粒组小鼠体内E2和8-OHdG水平均明显降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图3 2组MMTV-PyMT小鼠血清雌二醇（E2）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）水平比较Figure 3 Comparison of serum levels of estradiol（E2）and 8-hydroxy-2 deoxyguanosine（8-OHdG）between the two groups of MMTV-PyMT mice

图4结果显示：第9周后，与模型组比较，金蓉颗粒组小鼠体内ROS水平显著下降（P＜0.05），而SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC等抗氧化酶水平变化不显著（P＞0.05）；第15周后，金蓉颗粒组小鼠体内ROS水平下降，抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC）水平上升，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图4 2组MMTV-PyMT小鼠氧化指标水平比较Figure 4 Comparison of oxidation index levels between two groups of MMTV-PyMT mice

以上结果表明，金蓉颗粒可减轻雌激素诱导癌变过程的氧化应激反应。

2.3 金蓉颗粒对MMTV-PyVT小鼠乳腺肿瘤组织形态学的影响 图5结果显示：第9周后，模型组表现为乳腺腺瘤（见图5-A、图5-B），金蓉颗粒组表现为乳腺轻度增生（见图5-E、图5-F）。放大倍数后可发现：模型组细胞核质比增大，细胞增殖填充并扩张紧密的腺泡和导管，原发肿瘤体积显著增加（见图5-B）；金蓉颗粒组细胞核质比稍增大，导管肌上皮细胞呈扁平状（见图5-F）。第15周后，金蓉颗粒组可见乳腺腺瘤病理表现（见图5-G、图5-H），模型组可见乳腺癌早期表现（见图5-C、图5-D）。放大图中可观察到，模型组肿瘤细胞呈多形性，而肿瘤腺泡则表现为轮廓模糊，另见腺泡周围较多白细胞浸润，血管生成显著增加（图5-D）。

图5 2组MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤组织形态学变化比较（HE染色）Figure 5 Comparison of morphological changes of breast tumor tissue between the two groups of MMTV-PyMT mice（HE staining）

2.4 金蓉颗粒对MMTV-PyVT小鼠肺部转移的影响 图6结果显示：第9周后，2组肺内均未见转移灶。第15周后，金蓉颗粒组未发现转移灶，模型组肺部发现数个转移灶，肿瘤细胞核质比明显增大，肺泡和肺导管正常结构消失。

图6 2组MMTV-PyMT小鼠肺组织形态学变化比较（HE染色，×10）Figure 6 Comparison of histomorphological changes of lung tissues between the two groups of MMTV-PyMT mice（HE staining，×10）

2.5 金蓉颗粒对MMTV-PyVT小鼠乳腺肿瘤组织Laminin表达的影响 第15周后，模型组乳腺肿瘤组织中Laminin呈强阳性表达，而金蓉颗粒组中的Laminin呈阴性表达，见图7。金蓉颗粒组Laminin的平均光密度值为（0.089±0.005），低于模型组（0.287±0.031），差异有统计学意义（t=10.709，P=0.000）。

2.6 金蓉颗粒对MMTV-PyVT小鼠乳腺肿瘤组织中Nrf2及下游分子表达的影响 第15周后，2组小鼠乳腺肿瘤组织中Nrf2、HO-1、NQO1的免疫组织化学染色结果见图8。金蓉颗粒组Nrf2的平均光密度值为（0.126±0.016），高于模型组（0.091±0.007），差异有统计学意义（t=-3.374，P=0.028）；金蓉颗粒组HO-1的平均光密度值为（0.090±0.008），高于模型组（0.035±0.008），差异有统计学意义（t=-8.432，P=0.001）；金蓉颗粒组NQO1的平均光密度值为（0.141±0.018），高于模型组（0.081±0.005），差异有统计学意义（t=-5.097，P=0.007）。

图8 2组MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤组织中Nrf2（A）、HO-1（B）及NQO1（C）免疫组化染色结果（第15周后）Figure 8 Immunohistochemical staining results of Nrf2（A），HO-1（B）and NQO1（C）in breast tumor tissue in the two groups of MMTV-PyMT mice（after week 15）

2.7 金蓉颗粒对MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤组织Nrf2及下游分子基因表达的影响 图9结果显示，第15周后，与模型组比较，金蓉颗粒组乳腺肿瘤组织中Nrf2及下游HO-1、NQO1 mRNA表达水平显著上升（P＜0.05），提示金蓉颗粒可激活MMTVPyMT小鼠Nrf2通路，促进其下游HO-1、NQO1的表达。

图9 2组MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤组织Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA表达水平比较Figure 9 Comparison of mRNA expression levels of Nrf2，HO-1，NQO1 in breast tumor tissue between the two groups of MMTV-PyMT mice

3 讨论

本研究结果证实了金蓉颗粒有抑制MMTVPyMT小鼠模型中乳腺自发肿瘤生长的作用。金蓉颗粒可有效抑制肿瘤生长，但对体质量无影响，说明金蓉颗粒在小鼠体内使用是相对安全的。

中医学认为，乳腺癌主要是因肝气郁滞、肝肾不足、冲任失调导致气滞血瘀、痰凝毒聚于经络而形成，其中，肝气郁滞、冲任失调是其关键病机，冲任失调是其核心环节[16-18，26]。金蓉颗粒是国医大师林毅教授根据中医调理冲任理论研制的中药创新药，方中：肉苁蓉、淫羊藿补肾助阳，郁金疏肝散结、活血止痛，三药共为君药，以达补肾助阳、疏肝活血、调摄冲任之功；莪术、丹参、益母草共奏疏肝活血之功，辅助君药调摄冲任，共为臣药；何首乌、女贞子、鳖甲补肾养血、滋阴润燥，佐以调摄冲任；且鳖甲辅以牡蛎软坚散结以治其标。全方共奏补肾助阳、疏肝活血、调摄冲任之效。药理学研究表明，金蓉颗粒（淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、制何首乌、鳖甲、牡蛎）中部分中药淫羊藿、肉苁蓉、郁金、莪术、女贞子、丹参的有效成分包括醌类、苷类、酚类、皂甙和生物碱等可以抑制乳腺癌或肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的周期阻滞或凋亡，抑制肿瘤的生长[27-33]，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移的作用[30，34-36]。郁金、丹参还可以通过调节Nrf2上游介质、Nrf2及其靶基因表达及Nrf2核易位等途径激活Nrf2信号通路，保护细胞免受氧化损伤，发挥预防癌症的作用[37-49]。

本研究结果表明，金蓉颗粒不仅能抑制MMTV-PyMT小鼠中乳腺自发肿瘤的生长，减少小鼠肿瘤发病数，还能延缓乳腺肿瘤进展，抑制乳腺肿瘤肺转移的发生。乳腺肿瘤发生转移的第一步是肿瘤细胞向周围组织和血管侵袭。研究表明，中药可通过下调转移相关酶、抑制血管生成等途径，抑制乳腺肿瘤细胞发生转移[40]。乳腺癌肺转移，涉及一个复杂的机制，其中，癌细胞来源的细胞外基质成分的功能起了积极作用，层黏连蛋白（Laminin）是细胞外基质成分的重要成员，能通过诱导的现象重塑肿瘤微环境促进癌细胞增殖，导致癌细胞更易发生侵袭、转移，发生肺转移[41]。本研究结果显示，模型组的乳腺肿瘤组织中Laminin呈强阳性表达，而金蓉颗粒组中Laminin表达水平明显下降，提示金蓉颗粒可以通过抑制乳腺肿瘤细胞衍生Laminin改变肿瘤微环境，达到抑制肿瘤细胞增殖及发生转移的作用。

既往研究提示，雌激素与乳腺癌发病关系密切[42-43]，雌激素的过度氧化代谢产物可与DNA结合形成脱嘌呤加合物，造成DNA损伤，导致基因组不稳定，诱导基因突变[2，44-45]。核转录因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞保护反应的主要调节因子，Nrf2的激活被认为有助于癌症的预防，因为Nrf2的表达控制着许多抗氧化和抗炎反应细胞保护基因的表达，是对抗致癌物、ROS和其他DNA损伤因子的主要细胞防御机制，维持细胞氧化还原状态[2-3，46-47]。激活的Nrf2可以调节细胞抗氧化调节因子，它可以上调正常细胞中HO-1、超氧化物歧化酶1（SOD-1）等下游基因的表达，以维持细胞内氧化还原平衡，抑制ROS依赖的DNA损伤和癌变，减少肿瘤发生[4，48]。Nrf2依赖的解毒酶如NAD（P）H-醌氧化还原酶1（NQO1）还可以促进雌激素的清除，被认为是一种防止雌激素相关癌变的重要机制[12]。本研究结果显示，金蓉颗粒能降低机体E2水平，降低ROS水平，提高抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC）的表达，下调8-OHdG水平，促进Nrf2及其下游HO-1、NQO1 mRNA的表达。结果表明，金蓉颗粒可以调节雌激素诱导癌变过程的氧化应激反应，抑制ROS中介物的产生和积累，提高机体抗氧化的防御能力，降低细胞DNA的氧化损伤，其抗雌激素的氧化、癌变效应的主要机制可能是通过ROS/Nrf2信号通路，激活Nrf2及其下游蛋白来抑制氧化应激，达到延缓乳腺癌变、抑制乳腺肿瘤的进展。

综上所述，本研究以MMTV-PyMT自发乳腺癌转基因小鼠作为动物模型，发现金蓉颗粒可明显延缓乳腺癌的发展，其可能是通过激活E2/ROS/Nrf2通路，抑制氧化应激过程，从而起到抑制乳腺癌进程的作用。本实验尚存在一定的局限性，如样本量过少，未对E2去势或加用ER受体拮抗剂进行激活ROS/Nrf2通路验证，未对ROS/Nrf2通路进行敲除或阻断验证，未进行有效物质基础的探讨，也未从细胞层面深入探索金蓉颗粒抗肿瘤的机制等。后续将在细胞实验上进一步研究，以期为乳腺癌的治疗提供潜在靶标，为乳腺癌治疗提供更多参考。