丹蛭降糖胶囊对糖尿病性骨质疏松大鼠的治疗作用及机制

侯保健， 胡菊萍， 严兆丹， 蔡莉， 张令晖

（湖北省第三人民医院，湖北武汉 430030）

糖尿病性骨质疏松（diabetic osteoporosis，DOP）是糖尿病常见的慢性并发症，以骨结构破坏、骨量降低及骨脆性增加为主要特征，已成为老年患者致残致死的主要原因[1-2]。中医药在抗骨质疏松方面的作用日益显著。DOP归属于中医学“骨痿”的范畴，以肾精虚损、血瘀阻络为主要病机。丹蛭降糖胶囊具有益气、养阴、活血的功效，临床可有效改善DOP患者骨代谢[3-5]。本研究旨在建立DOP大鼠模型，进一步观察丹蛭降糖胶囊对DOP大鼠的治疗作用及机制，以期为临床应用丹蛭降糖胶囊治疗DOP提供基础数据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 54只SPF级成年雌性SD大鼠，4～5周龄，体质量200～250 g，购自广东省医学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（粤）2020-0031。所有实验动物于开始实验前，适应环境饲养1周。动物实验的实施严格遵照《实验动物护理和使用指南》进行。

1.2 药物、试剂与仪器 丹蛭降糖胶囊（购自安徽中医药大学第一附属医院，批号：Z20090006）；盐酸吡格列酮片（江苏德源药业股份有限公司，批号：H20110048）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；血清雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）放射免疫检测试剂盒（北京原子高科股份有限公司）；胰岛素、骨钙素（OC）酶联免疫吸附分析（ELISA）检测试剂盒（上海信裕生物科技有限公司）；胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）抗体、Wnt1抗体、β-catenin抗体[艾比玛特医药科技（上海）公司]；苏木素-伊红（HE）检测试剂盒（上海莼试生物公司）；AU5400自动生化分析仪（美国Beckman公司）；光学显微镜、CKX53荧光显微镜（日本OLympus公司）；蛋白电泳仪（北京六一仪器）。

1.3 DOP动物模型建立 首先构建2型糖尿病模型[6]：用高脂饲料喂养大鼠6周，空腹饲养6 h后每日单次腹腔注射60 mg/kg STZ，连续注射3次后，当随机血糖＞16.7 mmol/L时判断2型糖尿病模型建立成功。假手术组大鼠采用常规饲料喂养。再构建DOP模型[7]：糖尿病模型大鼠腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉，俯卧位固定在手术台上，常规剃毛并消毒后，在大鼠背部正中线做3 cm纵向切口，在切口旁2 cm，髂棘上1 cm处钝性分离肌肉，眼科弯镊深入找到卵巢，切除双侧卵巢，逐层缝合皮肤，切口部位滴青霉素抗炎。采用PRODIGY全自动双能X线骨密度测量仪测量骨密度（BMC），当峰值减少≥2.5个标准差时判断为建模成功。假手术组大鼠仅找到卵巢，不结扎，只切除卵巢附近小块脂肪，其他步骤同上。

1.4 分组与干预方法 将54只大鼠按随机数字表分为假手术组，模型组，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组，每组9只。除假手术组外，其余各组均建立DOP大鼠模型。建模过程中大鼠感染死亡3只，最终模型组7只、中药低剂量组9只、中药中剂量组8只、中药高剂量组9只及吡格列酮组9只。成功建模1 d后，大鼠给药剂量按照成人与大鼠体表面积法[8]进行换算，中药低、中、高剂量组大鼠灌胃丹蛭降糖胶囊0.54、1.08、2.16 g·kg-1·d-1（相当于成人给药剂量的1/2、1、2倍），吡格列酮组灌胃盐酸吡格列酮10 mg·kg-1·d-1，模型组和正常组大鼠灌胃等体积生理盐水，连续8周。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平检测 末次灌胃后，采集大鼠尾部静脉血，应用血糖仪监测大鼠空腹血糖（FBG），采用放射免疫法检测血清E2、FSH及LH含量。

1.5.2 胰岛功能检测 应用全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖（FPG）及空腹胰岛素（FINS）水平，运用稳态模式评估法测定胰岛素抵抗指数（HOMAIR）及胰岛素敏感指数（ISI）。

1.5.3 骨代谢指标检测 采用酶联免疫吸附分析（ELISA）检测血清骨钙素（OC），应用贝克曼全自动生化免疫分析仪检测血清血钙（Ca）、血磷（P）和碱性磷酸酶（ALP）浓度。

1.5.4 股骨组织提取及HE染色法观察病理形态 采用颈部脱臼方法处死大鼠，取股骨入10%甲醛溶液中固定，纵向切片，放入脱钙剂中脱钙，石蜡包埋，制成切片4μm，低温保存留待后续实验。按常规HE染色方法操作，光学显微镜下观察股骨组织病理形态。

1.5.5 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测胰腺组织胰岛β细胞凋亡 取胰腺石蜡切片脱蜡至水，加入2 020μg/mL蛋白酶K溶液23℃孵育30 min，加入3%H2O2孵育15 min，擦片后加入50μL TUNEL反应液37℃孵育60 min。上述每步骤后PBS冲洗5 min，反复3次。再加入50μL转化剂-POD，使用抗荧光淬灭封片液封片。荧光显微镜下观察凋亡细胞，凋亡细胞呈荧光绿色，每张切片选择5个非重叠视野，计算胰岛β细胞凋亡率，细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测股骨组织IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表达 取股骨组织，裂解离心获得上清液，进行蛋白定量。上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）后将蛋白转至PVDF膜，封闭后加入一抗稀释液IGF-1R（1∶500）、Wnt1（1∶500）、β-catenin（1∶500）4℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，洗膜后避光环境下滴加显影液孵育60 s。最后采用Image-lab图像分析系统进行分析。

1.6 统计方法 采用GraphPad Prism8.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组数据服从正态分布，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法进行。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清E2、FSH、LH水平比较 表1结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠血清E2水平降低，FSH、LH水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组E2水平升高，FSH、LH水平降低（P＜0.05）；中药高剂量组上述各指标与吡格列酮组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，DOP模型大鼠性激素代谢紊乱，而丹蛭降糖胶囊干预后可调节DOP大鼠性激素代谢紊乱现象。

表1 各组大鼠血清雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平比较Table 1 Comparison of serum estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH）and luteinizing hormone（LH）levels among various groups of rats （±s）

表1 各组大鼠血清雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平比较Table 1 Comparison of serum estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH）and luteinizing hormone（LH）levels among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与吡格列酮组比较

组别假手术组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组吡格列酮组F值P值鼠数/只979899 E2/（pg·mL-1）24.03±6.71 15.33±3.03①18.05±5.70①②③19.14±5.03①②③22.55±5.30①②22.65±4.95①②3.193 0.015 FSH/（mIU·mL-1）3.25±0.94 5.77±1.30①4.31±0.88①②③4.20±0.93①②③4.08±0.71①②4.10±0.60①②6.408 0.001 LH/（mIU·mL-1）4.18±1.17 7.40±2.02①5.91±0.55①②③5.60±0.41①②③5.21±0.39①②5.08±0.48①②9.792＜0.001

2.2 各组大鼠胰岛功能比较 表2结果显示：与假手术组比较，模型组FINS、FPG及HOMA-IR值升高，ISI值降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组FINS、FPG及HOMA-IR值降低，ISI值升高（P＜0.05）；中药高剂量组上述各项指标与吡格列酮组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，DOP模型大鼠胰岛功能减退，而丹蛭降糖胶囊可改善DOP大鼠胰岛功能、降低血糖。

表2 各组大鼠胰岛功能比较Table 2 Comparison of islet function among various groups of rats （±s）

表2 各组大鼠胰岛功能比较Table 2 Comparison of islet function among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与吡格列酮组比较

组别假手术组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组吡格列酮组F值P值鼠数/只979899 FINS/（mIU·mL-1）18.56±5.68 32.55±4.58①29.30±4.15①②③28.47±4.03①②③24.17±3.97①②23.89±3.81①②10.480＜0.001 FPG/（mmol·L-1）5.58±1.10 24.36±4.50①19.66±3.90①②③18.74±4.15①②③12.14±3.23①②12.01±2.89①②32.400＜0.001 HOMA-IR 3.02±0.40 17.69±2.15①15.20±1.66①②③14.96±1.59①②③10.20±2.80①②10.14±2.63①②55.190＜0.001 ISI-3.11±0.25-6.54±0.61①-5.17±0.44①②③-4.96±0.50①②③-3.84±0.38①②-3.58±0.44①②66.310＜0.001

2.3 各组大鼠骨代谢指标比较 表3结果显示：各组间Ca、P含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组OC、ALP含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组OC、ALP含量降低（P＜0.05）；中药高剂量组OC、ALP含量与吡格列酮组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，DOP模型大鼠骨形成功能减退，而丹蛭降糖胶囊可改善DOP大鼠骨形成功能，起到骨保护作用。

表3 各组大鼠骨代谢指标比较Table 3 Comparison of bone metabolic indexes among various groups of rats （±s）

表3 各组大鼠骨代谢指标比较Table 3 Comparison of bone metabolic indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与吡格列酮组比较

组别假手术组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组吡格列酮组F值P值鼠数/只979899 OC/（ng·mL-1）2.11±0.49 4.26±0.77①3.11±0.41①②③3.14±0.40①②③2.66±0.25①②2.58±0.27①②21.160＜0.001 Ca/（mmol·L-1）2.37±0.18 2.60±0.12 2.58±0.16 2.49±0.13 2.39±0.12 2.41±0.15 1.120 0.311 P/（mmol·L-1）1.60±0.14 1.75±0.08 1.69±0.10 1.67±0.08 1.62±0.16 1.60±0.15 1.783 0.135 ALP/（mmol·L-1）92.54±10.25 185.44±15.63①152.47±12.55①②③149.80±13.36①②③133.07±10.22①②131.60±9.44①②53.950＜0.001

2.4 各组大鼠股骨组织病理形态比较 图1结果显示：假手术组大鼠骨小梁粗壮、饱满及形态结构完整，结构排列较紧密；模型组骨髓腔较大，骨小梁数目较少且结构稀疏，存在骨小梁断裂；与模型组比较，中药低、中剂量组骨髓腔相对较小，骨小梁宽度增大，但未呈现网状分布；中药高剂量组及吡格列酮组骨组织病理形态较模型组明显改善，可见骨小梁体积变宽，骨小梁间隙减小且形态结构完整，排列规则。

图1 各组大鼠股骨组织病理形态比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histopathological morphology of the femur tissue among various groups of rats（HE staining，×200）

2.5 各组大鼠胰腺组织胰岛β细胞凋亡率比较图2结果显示：假手术组，模型组，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组胰腺组织中胰岛β细胞凋亡率分别为（0.00±0.00）%、（18.05±1.21）%、（11.98±0.63）%、（10.47±0.80）%、（3.69±0.28）%及（4.02±0.33）%，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组胰岛β细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组胰岛β细胞凋亡率降低（P＜0.05）；中药高剂量组胰岛β细胞凋亡率与吡格列酮组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠胰腺组织胰岛β细胞凋亡比较（TUNEL法）Figure 2 Comparison of apoptosis of pancreaticβ-cells in pancreatic tissue among various groups of rats（TUNEL method）

2.6 各组大鼠股骨组织IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表达比较 表4、图3结果显示：与假手术组比较，模型组IGF-1R蛋白表达水平升高，Wnt1、β-catenin蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及吡格列酮组IGF-1R蛋白表达水平降低，Wnt1、β-catenin蛋白表达水平升高（P＜0.05）；中药高剂量组上述各指标与吡格列酮组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组大鼠股骨组织IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白Western Blot电泳条带图Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of IGF-1R，Wnt1 andβ-catenin proteins in femoral tissues in various groups of rats

表4 各组大鼠股骨组织IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表达比较Table 4 Comparison of protein expressions of IGF-1R，Wnt1 andβ-catenin in femoral tissues among various groups of rats （±s）

表4 各组大鼠股骨组织IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表达比较Table 4 Comparison of protein expressions of IGF-1R，Wnt1 andβ-catenin in femoral tissues among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与吡格列酮组比较

组别假手术组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组吡格列酮组F值P值鼠数/只979899 IGF-1R蛋白相对表达量0.32±0.05 1.20±0.22①0.71±0.12①②③0.65±0.18①②③0.46±0.10①②0.49±0.09①②40.940＜0.001 Wnt1蛋白相对表达量1.80±0.10 0.32±0.0①0.76±0.08①②③0.78±0.07①②③1.08±0.10①②1.02±0.07①②308.900＜0.001 β-catenin蛋白相对表达量1.13±0.20 0.41±0.05①0.73±0.11①②③0.78±0.09①②③0.96±0.13①②0.92±0.12①②28.940＜0.001

3 讨论

糖尿病骨质疏松（DOP）是慢性的糖尿病并发症，发病机制复杂。大量的流行病学研究结果表明，1型糖尿病患者是低骨密度的，与没有糖尿病的对照组比较有更高的骨折风险[9]，这提示胰岛素是骨的促合成因素。本研究结果显示，丹蛭降糖胶囊可使DOP大鼠FINS、FPG及HOMA-IR值降低，ISI值升高，胰岛β细胞凋亡率降低，表明丹蛭降糖胶囊可改善DOP大鼠胰岛功能，抑制胰岛β细胞凋亡，抑制胰岛素抵抗，推测其可能是通过该机制抑制骨量丢失。

骨代谢异常是DOP患者主要的病理学特征。调节骨代谢对于改善DOP具有重要意义。碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞分泌的酶蛋白，是成骨细胞成熟的特异性标志，是反映骨代谢的重要指标[10]。骨钙素（OC）是由成骨细胞合成和分泌的非胶原骨基质蛋白，为骨转化、骨形成标志物[11]。本研究结果显示，丹蛭降糖胶囊可使DOP大鼠血清ALP、OC水平降低，表明丹蛭降糖胶囊可增强DOP大鼠成骨细胞活性，促进骨形成，改善骨代谢。钙（Ca）、磷（P）等指标代表骨组织无机物的代谢状态，本研究结果显示，各组间Ca、P水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），推测该结果可能是无机物代谢速度较慢的原因。

胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）是胰岛素样生长因子1（IGF-1）的受体，参与糖代谢和骨代谢过程[12-13]。研究表明，沉默IGF-1R后，成骨细胞增殖受到抑制，而凋亡增加[13]。Wnt/β-catenin信号通路是调控成骨细胞分化和骨基质形成的关键途径[14]。β-catenin高表达可以增加骨强度，改善骨量丢失[15]。研究表明，IGF-1R与Wnt/β-catenin信号通路存在交叉对话，IGF-1R可直接激活生长板软骨细胞β-catenin，还能抑制Wnt/β-catenin信号通路拮抗剂Dkk1（配体Wnt上游分子），促进Wnt/β-catenin信号通路转导，促进β-catenin表达[16]。本研究结果显示，DOP大鼠股骨组织中IGF-1R蛋白表达水平升高，Wnt1、β-catenin蛋白表达水平降低，丹蛭降糖胶囊干预后DOP大鼠股骨组织IGF-1R蛋白表达水平降低，Wnt1、βcatenin蛋白表达水平升高，表明丹蛭降糖胶囊可通过调节股骨组织IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平促进骨形成。

雌激素E2可直接作用于成骨细胞雌激素受体提高成骨细胞活性，促性腺激素FSH、LH与骨密度呈负相关[17]。2型糖尿病并发骨质疏松症患者血清性激素E2水平降低，FSH和LH水平升高[18]。本研究结果显示，丹蛭降糖胶囊可使E2水平升高，FSH和LH水平降低，表明丹蛭降糖胶囊干预后的DOP大鼠雌激素与促性腺激素代谢紊乱得到改善。

吡格列酮是具有代表性的噻唑烷二酮类药物，临床证实该药物具有在改善胰岛素抵抗及控制血糖的同时，可通过调控糖脂代谢紊乱而发挥骨保护作用[19]。故本研究选择吡格列酮作为阳性对照药物。本研究结果表明，高剂量的丹蛭降糖胶囊对各指标的改善作用均与吡格列酮相当。

综上所述，丹蛭降糖胶囊可通过改善胰岛功能，改善骨代谢，调节性激素代谢紊乱，抑制IGF-1R表达、激活Wnt1、β-catenin表达，发挥抗糖尿病性骨质疏松作用。