鹧鸪茶对高脂血症痰浊阻遏证患者的降脂效果及肠道菌群的影响

卓书江， 张明， 林道斌

（海南省中医院心血管内科，海南海口 570203）

高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是由遗传因素、不良饮食习惯及其他疾病引起的脂质代谢紊乱性疾病[1]。其主要表现为血液总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein，LDL-C）水平升高及高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein，HDL-C）水平下降[2]。而血液中的脂质代谢异常是引发冠心病、中风及心肌梗塞的重要危险因素[3]。最近的一项《中国居民营养与慢性病状况报告》[4]显示，我国居民高脂血症患病率已高达40.4%，表明高脂血症已经成为我国日益突出的一个重要公共卫生问题。但目前临床上的降血脂药物长期服用具有一定的毒副作用[5-6]。因此，积极开发新型降脂药物及药物靶点具有很高的临床价值。

鹧鸪茶又名山苦茶，为大戟科野桐属植物，在海南省万宁、琼中、乐东等市县广泛分布，具有减肥、降压之效，是海南的一种具有民族特色和地域特色的代茶饮料植物和药用植物[7]。为了探讨鹧鸪茶对高脂血症患者的降脂效果及其对肠道菌群的影响，本课题组开展了相关临床试验，现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组 收集2021年1月至2022年1月在海南省中医院心血管内科就诊并明确诊断为高脂血症痰浊阻遏证的40例患者作为研究对象。按就诊先后顺序，采用随机数字表法将患者随机分为试验组和对照组，每组各20例。本研究通过海南省中医院伦理委员会审核批准，伦理审查批号：HNSZYY-2020-LL-042。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 高脂血症的诊断标准参照《中国成人高脂血症防治指南（2016年修订版）》[8]，在不改变受试者生活饮食习惯的前提下，检测患者进食后12 h的血脂水平，1周内出现2次以上下列情况之一者，即可诊断为高脂血症：①TG＞1.70 mmol/L；②TC＞5.18 mmol/L；③LDL-C＞3.37 mmol/L；④HDL-C＜1.04 mmol/L。

1.2.2 中医辨证标准 痰浊阻遏证的辨证标准参照国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》[9]拟定。主症：形体肥胖，头重如裹，呕恶痰涎；次症：口淡，食少；舌脉：舌胖，苔滑腻，脉弦滑。以上主症见1项，次症见2项或以上者，结合舌脉表现即可确诊。

1.3 纳入标准 ①符合上述高脂血症的西医诊断标准和痰浊阻遏证的中医辨证标准；②既往未服用降血脂药物，或纳入试验前2周已停止服用降血脂药物，血脂水平符合诊断标准；③年龄在18～75岁之间，性别不限；④属于原发性高脂血症；⑤了解本研究内容，自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1.4 排除标准 ①对试验药物过敏的患者；②半年内曾发生心脑血管意外和重大手术的患者；③正在使用激素或免疫抑制剂治疗的患者；④因其他心脑血管疾病需要长期服用降脂药物的患者；⑤继发性高血脂症及遗传因素导致的高脂血症患者；⑥合并有肝肾功能异常或其他严重疾病的患者；⑦妊娠期或哺乳期妇女；⑧因其他疾病需长期服用中药或中成药的患者；⑨在试验前3个月曾使用抗生素或益生菌的患者。

1.5 剔除及脱落标准 ①治疗期间私自服用其他中药或中成药的患者；②治疗过程中出现不良反应的患者；③依从性较差，未按要求进行运动锻炼或不能按时用药和不配合相关检查的患者；④研究过程中因其他突发情况需使用降脂药物、抗生素或益生菌的患者。若患者出现以上情况而完成疗程过半且采集到合格粪便标本，则计入观察病例，否则予以剔除。

1.6 干预方法 根据《中国成人高脂血症防治指南（2016年修订版）》的推荐治疗方式，2组患者进行有规律的慢跑运动，每次30 min，每周至少4次。4周为1个疗程，共治疗2个疗程。试验组在此基础上饮用鹧鸪茶袋泡茶（药材产于海南省万宁市东山岭，袋泡茶由海南省中医院中药房提供）治疗，每日3次，每次用200 mL开水冲泡，于餐前或餐后30 min当茶饮，每次剂量为12 g。4周为1个疗程，共治疗2个疗程。治疗期间，患者保持既往饮食习惯，且禁止服用抗生素、益生菌及其他中药和中成药。

1.7 观察指标及疗效判定标准

1.7.1 中医证候评分及疗效判定标准 参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[10]，对形体肥胖、头重如裹、呕吐痰涎、口淡及食少等中医证候进行分级量化评分。并根据治疗前后中医证候积分的变化情况评价2组患者的疗效。中医证候疗效判定标准：显效：中医临床症状和体征明显改善，中医证候积分减少≥70%；有效：中医临床症状和体征有所改善，30%≤中医证候积分减少＜70%；无效：中医临床症状和体征无明显改善甚至出现恶化，中医证候积分减少＜30%。中医证候积分减少率=（治疗前积分－治疗后积分）/治疗前积分×100%；总有效率=（显效例数+有效例数）/总病例数×100%。

1.7.2 体质量指数（body mass index，BMI）测定 所有患者纳入研究时及干预结束后，均测量身高及体质量，并根据公式计算BMI：BMI=体质量（kg）/身高（m）2。

1.7.3 血脂指标检测 2组患者均于治疗前后各采集一次空腹8 h静脉血，血液样本经离心后，采用全自动生化分析仪检测血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平，血脂指标检测由医院检验科完成。

1.7.4 肠道菌群检测

1.7.4.1 粪便标本采集 2组患者均于治疗结束后采集一份新鲜粪便标本，置于专用无菌采便管，编号后在低温运送条件下迅速保存于-80℃冰箱中备用。为作对比，除了上述2组患者外，课题组还采集了10位在我院体检中心体检的健康成人的粪便标本。

1.7.4.2 粪便DNA提取 将收集的样本采用美国MOBIO公司的MOBIOPowerSoil®DNA Isolation Kit试剂盒进行DNA的提取，所得DNA提取液保存于-80℃的冰箱中。进行基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性、纯度和浓度。

1.7.4.3 PCR扩增及产物电泳检测 首先，标本16SrRNA V3V4区域扩增：以基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物及Ta Ka Ra Premix Taq®Version2.0（TaKaRa Biotechnology Co.，Dalian，China）进行PCR扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的片段长度和浓度，主带长度在正常范围内（16SV3V4～460 bp左右）的样品可用于进一步的实验。其次，Pooling及切胶纯化：利用Gene ToolsAnalysis Software（Version4.03.05.0，SynGene）对PCR产物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各PCR产物进行混合。使用EZNA GelExtraction Kit（Omega，USA）凝胶回收试剂盒回收PCR混合产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段。

1.7.4.5 生物信息学分析 物种序列采用GreenGene数据库注释，置信度阈值设置为0.5。通过操作分类单元（OTU）的韦恩（Venn）图分析，对物种及其丰度分析以及主坐标分析进行处理。韦恩图绘制了每组样本共有的OTU数量及其特有的OTU，展示各组样本间OTU的重叠情况。将物种及其丰度分析与数据库进行对比，将物种分为门、纲、目、科、属、种，并分析其在每组样品中所占的比例。样品组间多样性差异大小的观察主要用主坐标分析方法，两样品距离越近，则表示两样品的物种组成差异越小。

1.7.4.6 菌群16SrDNA测序 16SrDNA V3V4区域采用前引物为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，后引物为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，按照NEBNext®UltraTMDNALibrary Prep Kit for Illumina®（New England Biolabs，USA）标准流程进行建库操作，采用Illumina Hiseq2500平台对构建的扩增子文库进行PE250测序。再使用QIIME软件、R软件及Mothur软件等对测序结果进行alpha多样性、beta多样性、菌群分类学组成等一系列的综合性分析及处理。

1.8 统计方法 应用SPSS25.0统计软件进行数据的统计处理。计量资料（均符合正态分布）以均数±标准差（±s）表示，经方差齐性F检验，方差齐者采用t检验（其中，组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验），方差不齐者改用t’检验；计数资料（四格表资料）用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。均采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者脱落情况及基线资料比较 研究过程中，2组患者均能完成全部疗程的观察，均无脱落剔除病例。对照组20例患者中，男10例，女10例；年龄18～75岁，平均年龄为（56.35±9.99）岁。试验组20例患者中，男11例，女9例；年龄18～75岁，平均年龄为（55.55±12.62）岁。2组患者的性别、年龄等基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 2组患者中医证候疗效比较 表1结果显示：干预8周后，试验组的总有效率为95.0%（19/20），对照组为15.0%（3/20），组间比较（Fisher精确概率法），试验组的中医证候疗效明显优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 2组高脂血症痰浊阻遏证患者中医证候疗效比较Table 1 Comparison of the TCM syndrome efficacy between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome [例（%）]

2.3 2组患者治疗前后中医证候积分比较 表2结果显示：治疗前，2组患者的形体肥胖、头重如裹、呕吐痰涎、口淡及食少等证候积分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，试验组的形体肥胖、头重如裹、呕吐痰涎、口淡及食少等证候积分均较治疗前改善（P＜0.05或P＜0.01），而对照组仅形体肥胖及口淡等证候积分较治疗前改善（P＜0.05）；组间比较，试验组对各项中医证候积分的改善作用均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 2组高脂血症痰浊阻遏证患者治疗前后中医证候积分比较Table 2 Comparison of the TCM syndrome scores the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment between （±s，分）

表2 2组高脂血症痰浊阻遏证患者治疗前后中医证候积分比较Table 2 Comparison of the TCM syndrome scores the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment between （±s，分）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，与治疗前比较；③P＜0.05，与对照组治疗后比较

组别对照组试验组时间治疗前治疗后治疗前治疗后例数/例20 20 20 20形体肥胖2.60±1.95 1.90±1.65①2.50±1.43 0.80±1.19②③头重如裹2.00±1.58 1.80±1.43 2.80±1.36 0.60±0.94②③呕吐痰涎1.80±1.82 1.60±1.39 1.40±1.14 0.60±0.94①③口淡1.35±1.13 1.15±1.04①1.80±1.22 0.45±0.60②③食少1.20±0.95 1.05±0.75 1.55±0.88 0.45±0.60②③

2.4 2组患者治疗前后BMI比较 表3结果显示：治疗前，2组患者的BMI比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，试验组患者的BMI较治疗前明显降低（P＜0.05），对照组患者的BMI较治疗前有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；组间比较，试验组对BMI的降低作用明显优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 2组高脂血症痰浊阻遏证患者治疗前后体质量指数（BMI）比较Table 3 Comparison of the body mass index（BMI）between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment （±s）

表3 2组高脂血症痰浊阻遏证患者治疗前后体质量指数（BMI）比较Table 3 Comparison of the body mass index（BMI）between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment （±s）

注：①P＜0.05，与治疗前比较；②P＜0.05，与对照组治疗后比较

组别对照组试验组时间治疗前治疗后治疗前治疗后例数/例20 20 20 20 BMI/（kg·m-2）23.39±1.95 22.82±1.58 24.03±2.55 21.77±1.59①②

2.5 2组患者治疗前后血脂指标比较 表4结果显示：治疗前，2组患者的TC、TG、HDL-C及LDL-C等血脂指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，2组患者的TC、TG、LDL-C水平均较治疗前降低（P＜0.01），试验组患者的HDL-C水平较治疗前升高（P＜0.01），对照组的HDL-C水平较治疗前有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；组间比较，试验组对TC和LDL-C水平的降低作用及对HDL-C水平的升高作用均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 2组高脂血症痰浊阻遏证患者治疗前后血脂指标比较Table 4 Comparison of the blood lipid indexes between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment [±s，（mmol·L-1）]

表4 2组高脂血症痰浊阻遏证患者治疗前后血脂指标比较Table 4 Comparison of the blood lipid indexes between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment [±s，（mmol·L-1）]

注：①P＜0.01，与治疗前比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与对照组治疗后比较

组别对照组试验组时间治疗前治疗后治疗前治疗后例数/例20 20 20 20 TC 5.91±0.45 5.44±0.66①6.12±0.41 5.04±0.32①②TG 2.16±0.23 1.71±0.22①2.07±0.26 1.64±0.23①HDL-C 1.07±0.28 1.14±0.26 0.91±0.28 1.41±0.30①②LDL-C 3.94±0.32 3.15±0.49①3.87±0.32 2.60±0.46①③

2.6 16SrDNA测序结果 为了比较鹧鸪茶对肠道菌群的影响，本研究共采集了50个粪便样本，包括10个健康人样本，20个试验组的样本，20个对照组的样本。提取样本的16SrDNA序列，并对其进行测序，鉴定物种类别和相对含量。

2.6.1 肠道微生物α多样性分析 采用Evenness、Richness、Shannon index三个参数描述菌群的alpha多样性，结果显示：相较于其他两组，试验组的多样性最高（P＜0.05），而对照组的多样性又高于健康人群（P＜0.05）。结果见图1。

图1 各组肠道菌群alpha多样性比较Figure 1 Comparison of alpha diversity of intestinal flora in the trial group，control group and healthy volunteers

2.6.2 肠道微生物β多样性分析 图2是beta多样性排序的结果，我们选择最常见的beta多样性排序方法主成分分析法（PCA），并且配套对应的群落差异检测内容。从图中可以看出，3组之间菌群组成差别较大，而每组内部都比较一致。

图2 试验组、对照组及健康人群肠道菌群beta多样性PCA分析结果Figure 2 Results of PCA analysis of beta diversity of intestinal flora in the trial group，control group and healthy volunteers

2.6.3 门属水平肠道菌群序列分类分析 图3结果显示：对照组的厚壁菌门（Firmicutes）占主导地位，它的相对含量远高于健康人群和试验组（P＜0.05）。相较于对照组，试验组的厚壁菌门含量明显降低（P＜0.05），而拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形 菌 门（Proteobacteria）的 含 量 明 显 升 高（P＜0.05），试验组与健康人群的各类菌群含量更为相似。对比试验组和对照组的门水平和属水平的微生物组成，说明鹧鸪茶对肠道微生物菌群的组成有显著影响。图4结果显示：各个样本的属水平含量在健康人群、试验组、对照组之间差异较大，而在各组内部菌群含量比较一致。

图3 各组肠道菌群门水平各类物种的相对含量Figure 3 Relative content of various species of intestinal flora at the phylum level

图4 各组各个样本属水平的微生物含量的热图Figure 4 Heat map of microbial content at the genus level for each sample from various groups

2.6.4 代谢功能和代谢产物的差异 采用Tax4Fun软件计算各个样本代谢功能的相对丰度，选取丰度最高的前20个功能和代谢通路进行展示（见图5和图6）。从图5可以看出，K02014在试验组中的含量低于健康人群和对照组。K02025、K02026、K2027三个糖转运相关蛋白在试验组显著升高（P＜0.05）。从图6可以看出，k02010、ABCtransporters在试验组中的含量高于健康人群和对照组（P＜0.05）。

图6 各组差异通路图（2）Figure 6 Differential pathway diagram（2）for various groups

3 讨论

高脂血症是心血管疾病的重要危险因素，如何降低血脂是心血管科医师及患者所关切的问题。中医认为，脾主运化水谷，布散精微。血脂亦由水谷所化生，并依赖脾的转输功能布散周身。嗜食肥甘厚味易于损伤脾胃，使脾失健运，不能将多余脂质运化，从而导致痰浊内生[11]。正如《景岳全书》[12]所言：“脾虚胃弱，元气不足，水谷不化气血反变痰涎”。也有报道[13]指出，痰浊与血脂异常密切相关，血脂异常可视为痰证的现代生物学内涵之一。由此可见，痰浊与高血脂是中西医对同一病机的不同表达。基于此，本研究对鹧鸪茶治疗高脂血症痰浊阻遏证患者的干预效果进行了观察，研究结果发现，在疗效方面，相较于单纯运动降脂的对照组，鹧鸪茶加运动降脂的试验组的中医证候疗效显著好转（P＜0.01）。在中医证候积分方面，试验组不仅治疗后的形体肥胖、头重如裹、呕吐痰涎、口淡及食少等证候较治疗前好转（P＜0.05或P＜0.01），而且好转幅度均明显大于对照组（P＜0.05）。在BMI方面，试验组治疗后的BMI较治疗前及对照组均下降（P＜0.05）。在血脂指标方面，2组治疗后的TC、TG、LDL-C水平均较治疗前降低（P＜0.01），试验组的HDL-C水平较治疗前升高（P＜0.01），对照组的HDL-C水平较治疗前有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；组间比较，试验组对TC和LDL-C水平的降低作用及对HDL-C水平的升高作用均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。基于上述结果，可以证实鹧鸪茶可有效改善高脂血症患者的中医证候及血脂水平。

目前普遍认为，人体的生命活动是细菌与细胞共同作用下的结果，其中约80%的细菌存在于肠道，参与了肠道营养物质的吸收、分布、代谢和排泄，微生物与宿主之间互相依存、互相制约，处于一个动态平衡的状态。当肠道菌群发生改变，可引起肠道吸收屏障的变化，引起肠道免疫系统的应答异常，从而参与多种疾病的发生及转归[14]。所以，为了探索鹧鸪茶的降脂机制，我们检测对比了健康人群、对照组和试验组的肠道菌群情况。结果发现，对照组肠道菌群中厚壁菌门含量明显高于试验组及健康人群（P＜0.05）。而研究[15]发现，厚壁菌会产生胆汁盐羟化酶（bile salt hydroxylase，BSH），BSH会将胆汁酸转化为二级游离胆汁酸。而二级游离胆汁酸可通过G蛋白偶联受体调节肝脏和脂质的代谢，从而引起血脂异常。本研究结果显示：相较于对照组，试验组经鹧鸪茶干预后厚壁菌门含量明显下降（P＜0.05）。此外我们还发现，经鹧鸪茶干预后，试验组患者的拟杆菌门和变形菌门含量较对照组明显增加（P＜0.05），而有报道[16]指出，这两种菌群都是促进血脂代谢的有益菌。

最后，我们运用Tax4Fun软件计算各个样本代谢功能的相对丰度，结果发现，试验组糖转运相关蛋白显著升高。而有研究[17-18]证实，糖转运相关蛋白表达水平低下是胰岛素抵抗发生的分子机制之一，而胰岛素抵抗又会导致血脂代谢障碍。

综上所述，鹧鸪茶可有效改善高脂血症痰浊阻遏证患者的中医证候、体质量指数和血脂指标，其可能是通过调节患者的肠道菌群途径实现的。