血清HE4在慢性肾脏病中的表达水平及机制研究进展*

高冉冉，胡洪贞，韩 聪，宋慧慧，申 振，艾珊珊 综述,李 伟△ 审校

1.山东中医药大学，山东济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，山东济南 250014

慢性肾脏病(CKD)作为一种慢性疾病，在世界范围内发病率逐年上升，全球负担巨大，全球约10% 的成年人受到某种形式的慢性肾脏疾病的影响，每年导致120万人死亡[1]。肾脏纤维化是慢性肾脏病的主要特征之一，若不及时进行有效干预治疗，将逐渐导致终末期肾脏病(ESRD)。而一旦发展为ESRD，常需进行肾脏替代治疗，将给患者带来巨大的经济负担和精神压力。目前，CKD通常依赖于估算肾小球滤过率(eGFR)来进行分级，eGFR会受血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)等因素影响，然而STEUBL等[2]研究表明，在40%～50%的肾实质受到可逆或不可逆损伤时血清中肌酐的浓度才会升高，因此血肌酐在CKD早期诊断中缺乏特异性。某些生物学标志物可以预测CKD的进展，寻找高灵敏度和特异度的生物学标志物进行早期筛查干预，能有效延缓CKD进展为终末期肾脏病的进程和降低死亡率，提高患者预后和生存质量。近年来人附睾蛋白4(HE4)作为肿瘤标志物被广泛应用于卵巢癌等癌症的早期筛查中。后有研究发现在非肿瘤慢性肾脏病患者中血清HE4水平普遍升高，有学者认为其升高主要与eGFR下降和HE4作为蛋白酶抑制剂参与肾纤维化的进程相关，但分析尚不全面，未充分阐明其机制。本文就血清HE4和慢性肾脏病、肾脏纤维化之间的潜在联系作一综述，以探讨HE4在慢性肾脏病和肾脏纤维化中的表达影响机制，进一步探究其临床意义，以期提高其临床应用价值。

1 HE4

1.1HE4的生物学特性及功能 HE4最早在1991年由Kirchhoff从人附睾上皮中克隆出来，也被称为WAP四二硫化物核心域蛋白2(WFDC2)。HE4基因多表达在呼吸系统和生殖系统管道上皮细胞，后研究发现HE4在肾脏远曲小管中也有表达[4]。其蛋白结构属于含4个二硫键核心区域的乳酸性蛋白家族，包含八个半胱氨酸组成的WAP结构[3]，是一种相对分子质量较小的、酸性的、半胱氨酸含量丰富的分泌性糖基化蛋白[4]。现研究发现HE4的已知编码基因位于染色体20q12-13.1上，长度约12 kb，包含4个内含子和5个外显子，相对分子质量约为25×103[5]，已被证实是一种新型蛋白酶抑制剂，能抑制各种丝氨酸蛋白酶、胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和基质金属酶蛋白的活性[6]。WFDC2基因启动子含有不同的与炎症相关的转录因子结合位点，包括NF-KB因子，表明HE4可能在炎症中发挥潜在作用[4]，此外HE4还具有促进细胞增殖和肿瘤生长、入侵迁移和黏附的作用[7]。

1.2人附睾蛋白的影响因素 目前研究表明HE4基因多在卵巢癌患者体内表达明显[7]，与癌症的进展和转移相关，在临床上多作为诊断卵巢癌的生物学标志物[8]。有学者在研究血清HE4时提出除肿瘤因素影响外，血清HE4水平还受多种人口统计学变量的影响，如年龄、性别、吸烟史、更年期、怀孕或体重指数升高等[9-10]。FERRARO等[9]的一项系统评价结果显示，HE4血液浓度男性比女性大约低7%～9%，吸烟者比不吸烟者高20%～30%，与体质量指数成负相关；绝经状态和年龄都是影响HE4水平的重要因素，年龄主要影响绝经后女性HE4水平。绝经后人群的HE4水平高于绝经前人群，并随着年龄的增长而升高。近年来不少报道中指出血清HE4浓度会随着血肌酐水平升高而升高，两者呈正相关[11-12]。在BOLSTAD等[13]的一篇报道中指出以Scr为50 μmol/L作为基线，Scr为70 μmol/L时，HE4水平升高12%，80 μmol/L时升高17%，90 μmol/L时升高22%，100 μmol/L时升高27%。

2 HE4与CKD

2.1血清HE4作为肾功能进展标志物 通过Scr或胱抑素C(Cys C)估算eGFR是目前常用的评估肾功能的指标，但受人种、体型、饮食、药物等非滤过性病理及生理因素的影响，估算eGFR结果会存在偏差[14]。有研究表明,Scre和Cys C在CKD早期阶段表达水平缺乏特异性，当肾脏出现实质性损伤时浓度才会升高[15]，因此进一步寻找能早期反映肾功能的多样化生物学指标意义重大。

近年来，多项研究发现血清HE4浓度与肾功能程度之间有着密切的关联，宋勇林等[16]研究显示在CKD患者中血清HE4水平呈现升高且随着CKD分期的增高而升高，在该研究中ROC曲线分析结果显示，HE4对CKD的诊断价值优于β2-微球蛋白(β2-MG)、BUN等传统肾功能指标。WANG等[3]通过Person相关分析比较HE4浓度和常规肾功能指标相关性得出HE4与Scr、BUN和Cys C呈正相关，与GFR呈负相关，且HE4对CKD的诊断价值高于Scr、BUN和Cys C。由此可见，HE4可作为肾功能不全潜在诊断和预后判断的新型生物标志物[17]。

2.2血清HE4水平受肾功能进展影响机制 HE4相对分子质量约为25×103，相对分子质量相对较小可以通过肾脏滤过膜，当肾功能损伤时，肾脏的滤过和重吸收功能受影响，HE4的过滤受到干扰从而在血清中浓度升高[18]，在表达上呈现相对特异度。

肾周毛细血管稀疏，组织氧供减少是慢性肾脏病进展的一个重要因素[19]。慢性缺氧可通过诱导缺氧诱导因子1 (HIF-1)的激活，进而促进肾小管上皮细胞转分化、增加细胞因子、诱导肾小球内皮细胞凋亡等机制导致慢性肾脏病进展。张磊[20]构建HE4启动子的报告基因载体及其截短体，通过荧光素酶报告基因实验和CHIP实验表明HIF-1α通过直接结合在HE4启动子上转录调控HE4的高表达，缺氧可以显著增加肾小管上皮细胞中的HE4，上调HE4水平。

3 HE4与肾脏纤维化

3.1血清HE4作为肾脏纤维化程度标志物 CKD的终末病理结局以广泛肾脏纤维化为主要特征[21]。广泛肾脏纤维化作为慢性肾脏病终末病理结局的主要特征，其表现是肾脏固有细胞的纤维化，实质是肾固有细胞的受损坏死。早期发现和干预可以显著延缓病情进展，减少并发症，提高生存率。肾脏纤维化的诊断依赖于肾脏生理病理表现[22]，组织病理学检查目前被认为是诊断肾纤维化的金标准，然而肾活检存在一定的局限性，有发生并发症的可能[21]。确定灵敏和准确的肾纤维化无创生物学标志物对肾病患者的早期诊断和治疗至关重要。多项研究表明，在肾损伤的患者中血清HE4水平和肾纤维化水平呈正相关[23-26]。LUO等[27]在研究中用ROC分析血清HE4的诊断能力，以141 pmol/L为临界值，HE4的曲线下面积(AUC)值为0.857(95%CI，0.779～0.934)，用于区分有肾脏纤维化和无肾脏纤维化的患者，其灵敏度和特异度分别为82.1%和84.0%，免疫组化结果显示，肾活检标本中HE4表达的增加与肾脏纤维化密切相关，而血清HE4浓度与肾活检中HE4组织表达浓度显著相关，故血清HE浓度可反映肾脏纤维化。LINOQUIST等[28]通过比较纤维化相关成纤维细胞和正常成纤维细胞发现HE4在基因和蛋白水平上的表达水平显著增加，而且对1例遗传性肾炎患者的肾活检进行观察，他们发现HE4在人类纤维化肾脏中的表达升高。基于多项研究结果表明HE4可作为预测肾脏纤维化程度的潜在生物标志物。

3.2血清HE4水平受肾脏纤维化影响的机制 肾脏纤维化是多方因素共同作用的结果，是一个复杂的病理过程，其发生和进展由肾小球硬化、肾小管间质纤维化、炎细胞浸润以及肾实质丢失等共同参与[29]。此外，还有研究指出核转录因子-κB(NF-κB)信号通路、转生长因子β(TGF-β)/Smads信号通路是肾脏纤维化主要的通路[30]。关于肾脏纤维化的主要环节，ZHANG等[31]认为包括炎细胞浸润、细胞因子表达异常、上皮间充质转化、细胞外基质(ECM)异常堆积等是破坏肾脏正常组织结构并最终导致肾功能进行性丧失的主要原因。以下将主要围绕这几点展开论述血清HE4水平受肾脏纤维化影响的机制。

3.2.1HE4与肌成纤维细胞 活化的成纤维细胞，即肌成纤维细胞，其能表达平滑肌肌动蛋白，被认为是肾脏纤维化的关键介质[28]。LEBLEU等[34]使用α SMA-RFP转基因小鼠模型追踪和分离肌成纤维细胞，进行基因表达谱分析，发现肌成纤维细胞中HE4基因上调最高。

3.2.2HE4与炎细胞浸润 在纤维化启动初始阶段肾小管细胞损伤导致局部炎症形成，激活先天免疫系统，进而合成和释放促炎症和纤维化的细胞因子[28]。在炎细胞浸润促纤维化过程中，炎症细胞可产生纤维生长因子促进局部成纤维细胞或炎症细胞本身增殖产生ECM促纤维化；炎症细胞也可直接转化为胶原生成纤维母细胞或肌纤维母细胞促纤维化[32]。而炎症和感染可能是HE4分泌的补充因素，BENE等[33]研究发现炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-8的表达与HE4 mRNA具有相似的时间依赖变化模式，HE4受NF-κB通路和促炎信号传导上调。故在肾脏纤维化中血清HE4水平会上调。

3.2.3HE4与ECM异常堆积 纤维化过程中的典型标志是细胞外基质的过度沉积。关于细胞外基质异常堆积促纤维化，NOGUEIRA等[29]提到蛋白纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)、结缔组织生长因子(CTGF)、胶原Ⅰ、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)等促细胞外基质分子会使细胞外基质沉积增加，从而促进肾脏纤维化。一项研究在单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型中分析与ECM沉积相关基因时发现HE4表达显著上调[31]。研究认为基质金属蛋白酶及其组织抑制剂是ECM沉积的主要因素，而HE4作为一种蛋白酶抑制剂，可以抑制丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶等多种蛋白酶的活性，特异性地抑制I型胶原的降解，导致细胞外基质降解减少，介导肾脏纤维化[3,34]。此外，过表达的HE4还能激活NF-κB通路抑制MMP-2的表达，从而减少细胞外基质降解促进肾脏纤维化[20]，因此慢性肾病患者肾脏纤维化过程中血清HE4显著升高[23]。

3.2.4HE4与上皮间充质转化 关于上皮间充质转化(EMT)的最新研究表明上皮细胞附着于基底膜转化为肌成纤维细胞，上皮细胞经历细胞周期停滞和代谢改变，诱导免疫细胞浸润和扰乱上皮间充质串扰，启动和加速纤维化过程[35]。基于EMT中上皮细胞附着于基底膜转化为肌成纤维细胞这一研究结论，笔者推测可能在EMT过程中基底膜侵袭和黏附力增强，而HE4参与基底膜侵袭和黏附[7]，故血清中HE4表达可能上调。

4 讨 论

慢性肾脏病是指肾脏结构或功能异常>3个月[36]。涵盖病种广泛，主要包括各种原发的、继发的肾小球肾炎、肾小管损伤和肾血管的病变等，原发性病变主要包括膜性肾病、IgA肾病等，继发性病变主要包括糖尿病肾病、高血压肾病、过敏性紫癜肾炎、红斑狼疮肾炎等[37]。肾小球血管血流动力学的改变出现高灌注和高滤过状态、肾单位高代谢、肾组织上皮细胞表型转化、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活等均会促进肾脏纤维化，肾脏纤维化是慢性肾脏病进展为肾功能不全的共同通路[38]。随着病情的不断进展，各种心脑血管事件(如心肌梗死、中风、心力衰竭等)风险增加、患者总体死亡率的风险也显著增加[1]。据估计，到2040年CKD将成为全球第五大死亡原因，是所有主要死亡原因中预计增长最大的原因之一[39]。因此能及时发现、早期干预是延缓慢性肾脏病进展、减少并发症和提高生存率的关键[37]。

HE4是一种相对分子质量较小的、酸性的、半胱氨酸含量丰富的分泌性糖基化蛋白，具有蛋白酶抑制、炎症反应和促进细胞增殖、黏附的作用。血清HE4浓度在早期慢性肾脏病患者中升高[16,40]，与肾脏纤维化程度和血肌酐水平呈正相关，与eGFR之间负相关,对CKD的早期诊断价值更优于Scr、BUN和Cys C[3,16]，可作为反映CKD严重程度和肾脏纤维化程度的标志物。本文通过详细综述，分析其机制：在慢性肾脏病中，肾功能受损肾小球滤过功能下降导致血清HE4滤过受干扰，以及慢性肾脏病进展过程中组织缺氧增加肾小管上皮细胞中的HE4，故血清HE4水平升高；在肾脏纤维化过程中，HE4可通过抑制丝氨酸和基质金属蛋白酶等的活性促ECM沉积、随肌成纤维细胞表达上调、经NF-κB等信号通路促炎细胞浸润、参与EMT等介导肾脏纤维化。故血清HE4水平随肾纤维化程度进展而升高并可对慢性肾脏病预后评估有一定的指导意义。在目前肾活检因其有创性不被大多数患者所接受及其他生物学标志物在疾病早期灵敏度低的大环境下，血清HE4样本易收集且易于监测，能快速、经济的反映早期CKD进展情况以及肾脏纤维化程度，可应用于非肿瘤CKD患者的预后推测和风险评估，作为早期诊断和预后评估的新型生物学标志物具有重要意义。但目前对其研究尚不充分，只是依据现有研究作出的理论推测，仍需要进一步通过临床和实验研究来验证。此外，肾脏纤维化是加速肾功能恶化的主要原因，有研究报道[41]，HE4在纤维化过程中发挥着重要作用，抑制HE4可促进肾纤维化的改善，基于HE4介导肾脏纤维化进一步探讨能否以HE4为靶点进行肾脏纤维化的防治并改善肾功能，为临床提供了研究的新思路。