慢性难愈合创面“缸口”的形成机制和中医药治疗研究进展

马慧可 李 萍 陈 佳 林 燕 姚文涛 何秀娟

慢性难愈合创面是指因多种内在或外界因素导致创面长期处于溃烂、渗出或呈纤维化状态,不能按时完成正常的上皮化和及时的组织与功能修复,治疗4周后仍愈合缓慢或无明显愈合倾向的伤口[1]。慢性难愈合创面主要包括感染性溃疡、放射性溃疡、创伤性溃疡、癌性溃疡、动静脉溃疡以及皮片或皮瓣移植术后的坏死创面等[2]。慢性难愈合创面的发病机制包括慢性或过度炎症、修复细胞增殖受阻、局部高酶活性、氧化应激损伤以及生长因子分泌不足等[3]。“缸口”是指溃疡长期难以愈合,疮口下陷不收、边缘高突增厚,皮缘形如大缸环口之状。“缸口”形成多发生在创面修复的重塑期,表皮与真皮未能同步恢复,表皮缺损部位愈合过快或角质形成细胞积聚过多导致上皮变硬变厚,创面形成“缸口”,从而导致伤口愈合延迟。临床研究发现“缸口”是导致慢性难愈合创面的重要影响因素,缸口的深度与临床疗效密切相关。动物研究发现,创缘与创面之间形成的角度越大,越有利于局部炎性渗出物引流、伤口收缩以及肉芽组织中纤维母细胞与新生毛细血管的生长。创缘与创面形成的角度过小的溃疡,临床上多将创缘皮肤适当切除,一方面有助于改善炎性渗出物在创面的引流与其在上皮处的过度积聚,从而促进上皮细胞的爬行,另一方面有助于创面暴露出更多的真皮组织,以改善迟滞的上皮组织的生长与创面局部的氧分压,从而促进缺损组织的良性修复。因此,临床上及时并有效的处理创缘在极大程度上促进了慢性皮肤溃疡的愈合。

一、EMT过度导致慢性难愈合创面“缸口”形成

伤口的愈合过程经历止血期、炎症期、增殖期和重塑期,4个阶段必须相互协调,且以正确的时间和顺序整合以实现正常的创面修复[4]。在皮肤创面修复的增殖期和重塑期,表皮修复从创口边缘开始,涉及角质形成细胞的激活、迁移和增殖以覆盖新生肉芽组织,从而形成新生表皮并恢复表皮屏障功能,该过程被称为再上皮化,这也是伤口愈合过程中的关键阶段[5, 6]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表现为细胞上皮特性逐渐丢失而表现出间质的特性,细胞运动和迁移能力增强[7]。上皮特性的改变主要在于上皮细胞失去其原有的“上皮形态”,包括细胞-细胞间、细胞-外基质间和细胞-基底膜间的连接减弱,细胞极性消失,同时上调Slug、Snail1、Snail2、Zeb1和Twist等EMT相关基因。EMT可分为3型:Ⅰ型EMT参与胚胎生成和器官发育;Ⅱ型EMT参与创面愈合、组织再生和器官纤维化;Ⅲ型EMT参与肿瘤形成和转移[8]。其中,Ⅱ型EMT完全由损伤和炎症引起,一旦创面达到修复状态或炎症消退便会停止EMT的发生。在再上皮化过程中,皮肤创缘的角质形成细胞发生脱黏附,细胞骨架重排而变得疏松;这些改变同时使静止的角质形成细胞伸出板状伪足,实现细胞迁移[9]。再上皮化完成后,角质形成细胞会恢复上皮细胞表型,重建紧密的细胞连接和屏障功能,因此,再上皮化过程中的部分EMT是可逆的。在创面愈合早期,EMT来源的肌成纤维细胞可以通过分泌细胞外基质和收缩伤口床来缩小创面[2]。但是在创面愈合晚期,如果炎症持续刺激导致EMT无法及时消退,则会导致瘢痕形成。研究表明,转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)是发生EMT的诱导因子,EMT在皮肤创面愈合过程中参与炎性反应,促进成纤维细胞与血管增生,调节胶原合成等[10]。因此,其对于适当的上皮化和细胞外基质沉积是必要的,但持续的从上皮细胞到肌成纤维细胞的过度转化将导致纤维化[9]。

在皮肤创面愈合过程中,创缘上皮细胞迁移增强,细胞间黏附降低,角质形成细胞通过增殖、迁移驱动再上皮化,成纤维细胞介导局部结缔组织收缩,促进创面边缘闭合[11]。再上皮化是创面愈合的关键组成部分,因此,参与再上皮化的角质形成细胞是创面修复的主要参与者[12]。创面中的角质形成细胞通过细胞间黏附减少、细胞骨架蛋白重组以及基因重编程转换为具有间充质表型的细胞,从而实现再上皮化以恢复表皮屏障,这一过程是创面愈合的基础[8]。波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的增多以及E-钙黏蛋白(E-cadherin)的减少可作为判断EMT发生及其进展程度的标志[11]。在细胞极化条件下,E-cadherin与相邻细胞结合,形成上皮屏障的细胞间复合物,在相邻细胞的细胞骨架之间形成桥梁。EMT转录因子(如Snail、Slug和Twist)与E-cadherin启动子区E-boxs结合,下调E-cadherin来实现EMT[13]。然而,失去E-cadherin的细胞则不能相互黏附,因此E-cadherin表达水平的改变是判断细胞迁移、肿瘤浸润转移与否的重要标准。Snail与同一家族Slug可通过抑制E-cadherin来调节上皮再生过程中的角质形成细胞运动,减少细胞间黏附来实现EMT[9]。细胞骨架在经历特征性重组过程中,肌动蛋白介导应力纤维形成,以细胞角蛋白(cytokeratin, CK)为主的细胞骨架转变为以Vimentin为主的细胞骨架,调节细胞运动并发生EMT[14]。经EMT转化的细胞MMP2和MMP9上调,降解细胞外基质并促进细胞迁移。此外,局部降解的细胞外基质还会释放储存的生长因子如TGF-β1,促进细胞间充质表型的获得、侵袭和转移,进一步加强EMT[15]。

创面愈合过程中的EMT受到成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和TGF-β等多种信号通路的精细调节[16]。TGF-β调控细胞增殖、迁移、分化以及EMT,参与损伤修复和致纤维化。TGF-β超家族中TGF-β1与致纤维化密切相关。在慢性创面中,炎性巨噬细胞可分泌TGF-β1,刺激成纤维细胞增殖和合成细胞外基质,而皮肤创面边缘纤维化是慢性创面的重要发病机制[17]。TGF-β信号通路经Smad依赖型和Smad非依赖型通路发挥作用。TGF-β/Smad信号通路中,TGF-β配体结合TGF-βR1、TGF-βR2导致Smad2和Smad3磷酸化,之后与Smad4形成复合物并易位至细胞核,反式激活编码ECM、基质金属蛋白酶、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)和Snail基因的表达,最终促进EMT的形成[18]。同样,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)可结合TGF-β受体导致Smad1和Smad5磷酸化,也与Smad4形成复合物。同时,抑制性Smad6和Smad7也与Smad2和Smad3竞争性结合TGF-βR1[19]。这些Smad复合物(Smad2-Smad3-Smad4和Smad1-Smad5-Smad4)迁移到细胞核,并作为转录因子调节间充质状态相关基因的表达[18]。研究发现,TGF-βR1/TGF-βR2、Smad2-Smad3-Smad4失活均可以阻断TGF-β1诱发EMT。虽然Smad3可以诱发EMT,但Smad2可以抑制TGF-β1诱发EMT,并且Smad2缺陷的角质形成细胞通过增强Smad3和Smad4活性而发生EMT。因此,TGF-β是致纤维化的主要调节因子。

创伤修复与肿瘤发生均有细胞增殖与分化、组织重塑与炎性反应等过程的参与,并且涉及多条共用信号通路。2020年《Nature》报道,TGF-β通过RAS反应元件结合蛋白1(RAS responsive element binding protein 1, RREB1)协调EMT过程和纤维化[20]。TGF-β是EMT过程和纤维化的有效诱导因子,其依赖于迅速加速性肉瘤蛋白(rapidly accelerated sarcoma,RAS)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路来诱导EMT发生。RREB1和RAS转录效应子是EMT中TGF-β激活的Smad转录因子的关键伴侣,之后被MAPK激活以促使Smad被募集Snail,最后经染色质可极性诱导产生EMT。在癌细胞中,TGF-β/Smad和RREB1直接驱动Snail,促进肿瘤内纤维化。因此,RREB1促进RAS和TGF-β通路间的相互联系,诱导EMT过程和纤维化。

RREB1编码的蛋白是一种转录因子,参与细胞增殖、转录调控和DNA损伤修复等生物过程,能结合下游基因启动子区的Ras 反应元件(RAS-responsive elements,RRE)发挥作用,被认为是RAS/RAF信号通路转导的一个效应分子。RREB1基因位于人类6号染色体(6p25),全长144kb,编码的蛋白是具有15个锌指结构域的转录因子,目前已知存在12个异构体[21]。RREB1能诱导降钙素、p53、FSH等基因的转录,抑制血管紧张素原、p16、hZIP1、PSA、HLA-G等基因的转录。RREB1和雄激素受体、C-Terminal结合蛋白等核蛋白相结合,并参与microRNA、lncRNA、circularRNA等的调控。在实体肿瘤中RREB1与细胞迁移运动有关。MCF10A乳腺上皮细胞敲低RREB1后细胞的迁移与表面活性受到抑制,从而形成紧密的细胞集落[22]。因此,RREB1减少细胞间黏附促使细胞迁移,而RREB1低表达可通过抑制细胞迁移,在抗纤维化与抗肿瘤方面发挥重要作用。因此,慢性皮肤溃疡局部炎症持续存在,RREB1可能促进TGF-β/Smad和RAS/MAPK信号通路协同诱导EMT过程导致EMT过度甚至纤维化,是“缸口”形成的机制。

二、中医药抑制TGF-β/Smad和RAS/MAPK信号通路对EMT过度以及“缸口”的研究

慢性皮肤溃疡属中医“疮疡”范畴,中医药治疗疮疡显示了强大的生命力。疮疡的形成经历初起(初期)、成脓(中期)、溃后(脓成)3个阶段,总则为早期为消,中期为托,后期为补。顾筱岩认为,若臁疮经久难愈,疮面凹陷,疮周紫黑,质地僵硬,有如“缸口”之状,仅用生肌之法,则肉芽浮起而致新肉不生;若局部采用垫棉压迫法,可使肉芽平伏,并配合缠缚疗法,用布绑扎小腿,利于气血畅通,促进疮面愈合,日久便可见效[23]。创面愈合增殖期阶段的溃疡创面肉芽色淡白,疮周紫滞,致缸口形成,久不收敛,敛后复溃,管壁粗硬。郑勇等[24]采用祛瘀生肌法,主张旧瘀宜通滞,因此在补阳还五汤之基础上加用虫类药材,如水蛭取搜剔络邪之功。水蛭善入则坚积易破,借其力以攻积久之滞,自有得而无害也。疮面愈合重塑期阶段,疮周形成较厚硬且弹性差的灰白组织,形成“缸口”,阻碍新生上皮组织在疮面的爬行,从而形成慢性难愈合疮面。阙华发[25]认为,疮周有潜行性空腔时,采用垫棉疗法垫压空腔处,再以绷带加压缠缚,压紧患处,可促进皮肉黏合,利于创面愈合。对于“缸口”的处理,阙华发[25]认为可采用煨脓湿润法,油膏厚敷创面厚硬组织,待其软化后机械清除,并外敷生肌敛疮药膏,可促进上皮生长,加速疮面愈合。

TGF-β/Smad和RAS/MAPK信号通路诱导EMT过度导致慢性慢性难愈合创面“缸口”形成。中药复方或中药提取物可在创面愈合早期阶段上调TGF-β或TGF-β/Smad信号通路来促进创面愈合,但其在创面修复后期通过抑制EMT过度来促进创面修复的具体机制还有待于深入研究。张臻等[26]用益气化瘀方灌胃糖尿病大鼠,抑制TGF-β/ALK5/Smad2/3信号通路,促进糖尿病大鼠创面愈合并减少瘢痕形成。王振宜等[27]将复黄生肌愈创油膏外用于糖尿病大鼠,在创面修复晚期,下调TGF-β、Smad3表达,上调Smad7表达,促进创面愈合的同时阻止成纤维细胞过度增殖与迁移,从而减少瘢痕形成。孙桂芳等[28]将生肌玉红膏体外干预人增生性瘢痕成纤维细胞(hurean hyportrophic scar fibroblast, hHSF),抑制hHSF增殖、α-SMA和Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达,显著下调TGF-β/Smad信号通路;临床实践表明,生肌玉红膏可促进创面愈合,广泛应用于糖尿病性溃疡以及烧烫伤,效果显著;体内实验表明,生肌玉红膏可抑制瘢痕增生,减少胶原沉积,减轻兔耳增生性瘢痕。同样,血竭素B临床可应用于烧烫伤,促进创面愈合;同时,血竭素B可下调TGF-β1/Smad信号通路,减轻兔耳增生性瘢痕。王文淇等[29]将断体地龙提取液作用于小鼠创面,在创面修复后期,TGF-β下调,减少胶原沉积与瘢痕形成。这些数据表明,中药或中药提取物在促进创面愈合的同时,又可通过TGF-β/Smad信号通路发挥潜在的抑制瘢痕性增生的疗效。

赵炳南使用“治翻车”疗法治疗慢性皮肤溃疡疮周异常纤维化,疮面“缸口”板硬,利用黑布药膏的活血化瘀、软坚散结作用,缓慢软化创面痂皮,尽可能减小其对正常组织的损害[30]。外用黑布药膏可打破慢性创面的愈合停滞状态,清除异常纤维化的肉芽组织,促进正常肉芽组织的生长,重新启动创面的愈合机制。黑布药膏中老黑醋的软坚解毒、蜈蚣的破瘀攻毒以及五倍子的收敛解毒起关键作用,全方共奏破瘀软坚、聚毒催脓之功,以消为主,消中带托,破中有立[31]。另有研究表明,黑布药膏可显著降低局部组织中TGF-β1的表达,从而起到抑制瘢痕增生和挛缩发生的作用。此外,黑布药膏中蜈蚣和五倍子可显著抑制瘢痕疙瘩胶原蛋白的合成与hHSF的增殖,减少其DNA与胶原的合成。因此,黑布药膏可抑制TGF-β表达和成纤维细胞活性,从而发挥抗皮肤纤维化的作用。因此,TGF-β/Smad信号通路是调控创面愈合与抗EMT过度的关键机制,从该通路出发,进行中医药在EMT过度所致的慢性创面的疗效及药效基础研究具有广阔的研究前景。

三、展 望

EMT经过了近40年的发展,但皮肤EMT的相关文章比例不足3%,对创面修复的研究也是针对如何促进EMT,而对抑制或逆转皮肤EMT的研究仍比较欠缺。中医药一方面可加速创面愈合,一方面可通过抑制EMT与抗纤维化作用提高创面修复能力,从而有助于慢性难愈合创面“缸口”愈合。因此,抑制TGF-β/Smad和RAS/MAPK造成的EMT过程和纤维化可能成为促进创面愈合新的治疗靶点,将为研究中医药治疗慢性难愈合创面“缸口”的作用基础和理论内涵提供新的思路和方向。