中性粒细胞胞外诱捕网在类风湿关节炎发病机制中的研究进展

宋子怡 张升校 苏勤怡 李小峰

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性的、以累及关节为主的多系统自身免疫性疾病,病变早期关节主要病理特征为滑膜炎细胞浸润、滑膜增生和血管翳形成,晚期常发生关节畸形。RA患者外周血和滑膜液中存在特异性自身抗体,如抗瓜氨酸蛋白抗体(autoantibodies to citrullinated protein antigens, ACPAs)、抗氨甲酰化蛋白抗体及抗乙酰化蛋白抗体等[1]。其中ACPAs最为关键,在RA亚临床阶段可在血液中存在数年。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)是RA中瓜氨酸蛋白的重要来源,能刺激机体产生ACPAs。此外,NETs还能与滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)相互作用导致炎性反应增强。本文将重点概述NETs在RA发病机制中的关键作用及以NETs为靶点的药物在RA治疗中的新进展。

一、NETs的形成

NETs是中性粒细胞受到感染或炎症等刺激后失去细胞内膜完整性后释放的一种染色质纤维网状结构,主要成分为组蛋白、DNA和颗粒蛋白,网上分布的各种酶及抗菌肽可捕捉、固定并杀灭侵入机体的细菌。2004年,Brinkmann等[2]发现并报道了NETs,这是一种杀菌的新机制。NETs的形成与清除失衡与许多自身免疫性疾病的发生有关。

活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)介导了NETs的形成,其产生包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶(NADH oxidase, NOX)依赖途径与NOX非依赖途径[3,4]。在NOX依赖途径中,在微生物、血小板、免疫复合物(immune complexes, ICs)、自身抗体、细胞因子、药物、体外的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的强效激活剂乙酸肉豆蔻佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)和钙离子(Ca2+)等多种因素的刺激下,中性粒细胞被激活,其细胞膜上的NOX2进而产生ROS,ROS作用于嗜苯胺蓝颗粒(azurophilicgranules, AG),导致髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和中性粒细胞弹性酶(neutrophil elastase, NE)从AG转移到细胞核,这两种酶在细胞核中促使组蛋白分解和染色质解聚,随后中性粒细胞膜破裂,NETs形成[5,6]。在NETs形成过程中,激活的中性粒细胞能进一步诱导大量的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase, PAD)4产生,使组蛋白瓜氨酸化。在NOX不足时,线粒体可通过NOX非依赖途径产生ROS,促使NETs形成。刺激NETs形成的信号通路目前尚未完全明确,Raf-MEK-ERK可能起着关键性的作用。此外,有研究表明,NETs的形成与G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)和整合素等信号分子有关[7]。

中性粒细胞产生NETs并伴随细胞裂解、死亡的过程称为NETosis,是一种在形态学上不同于凋亡和坏死的新的细胞死亡方式[8]。NETosis的发生因刺激类型的不同分为自杀性和非自杀性。前者如上所述,最为常见,可在中性粒细胞受刺激后数小时内发生。后者则可在中性粒细胞受刺激后几分钟内发生,由金黄色葡萄球菌通过Toll样受体(toll-like receptors, TLR)2配体和补体受体或由大肠杆菌通过TLR4或TLR4激活的血小板诱导产生[9]。与自杀性NETosis一样,NE转移到细胞核中,促进染色质进一步解聚和核膜破坏,被蛋白质修饰的染色质通过小泡排出胞外。不同的是,中性粒细胞膜不被破坏且保留了趋化、吞噬、杀菌等功能。

二、NETs介导RA的发病机制

在生理状态下,NETs可对外界的危险信号产生防御反应。NETs可结合多种病原体并释放高浓度的抗菌物质以降低细菌毒力并杀死细菌,从而保护机体。然而,在慢性感染和炎性反应时,NETs可介导自身免疫反应并直接杀死上皮细胞和内皮细胞,导致组织充血、水肿及氧化损伤,促使RA发生、发展[10]。

RA发展过程中常有NETs的清除异常[11]。脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)是一种主要存在于血液和胃肠道中具有核酸内切酶活性的酸性糖蛋白,是NETs的重要降解因子。DNaseⅠ可能通过抑制ROS的产生从而减少NETs形成及促进已形成NETs降解发挥作用,但具体机制尚不清楚。研究发现,RA滑膜中的DNaseⅠ中几乎无活性,血清中的DNaseⅠ活性显著降低,且与红细胞沉降率(erythrocytesediment rate, ESR)、C反应蛋白(C reactive protein, CRP)和中性粒细胞计数等炎性指标呈负相关。因此,血清DNaseⅠ活性水平也许能作为评价RA活动性的指标[12]。DNaseⅠ的活性受损会导致NETs不能被有效清除,进而增加瓜氨酸化自身抗原的暴露,增加ACPAs的产生,导致关节炎症进一步恶化。

RA患者滑膜组织、类风湿结节和皮肤组织中有大量NETs的存在,对激活中性粒细胞的刺激因素更加敏感。外周血中NETs的百分比与血清CRP、ESR、ACPAs和IL-17水平也呈显著正相关[13]。NETs通过产生瓜氨酸蛋白等自身抗原、与环境因素相互作用诱导ACPAs产生以及促进滑膜成纤维细胞增殖和产生细胞因子等机制介导RA的自身免疫应答。

1. NETs是瓜氨酸蛋白等RA自身抗原的主要来源:RA患者在亚临床阶段体内即可出现自身抗原,其中瓜氨酸化组蛋白是RA中主要的抗原。在中性粒细胞形成NETs并杀灭病原体的过程中,组蛋白的瓜氨酸化是关键一步。瓜氨酸化是一种蛋白质翻译后的修饰过程,指蛋白质肽链中蛋白的精氨酸残基在PADs作用下脱亚氨基转化为瓜氨酸化蛋白。PADs包含5种同工酶(PAD1～4和PAD6),中性粒细胞广泛表达PAD2与PAD4。正常情况下PAD4无活性,但在氧化应激或自身免疫反应过程中,Ca2+进入细胞使其活化,导致组蛋白、弹性蛋白酶、天青蛋白和髓样细胞分化抗原等瓜氨酸化,增加了它们的抗原性[4]。此外,穿孔素和补体膜途径能使中性粒细胞形成孔隙,通过增加细胞内钙离子浓度激活PADs,使中性粒细胞蛋白广泛瓜氨酸化[14]。瓜氨酸化蛋白能刺激机体产生ACPAs,从而诱导自身免疫反应。RA患者外周血中NETs与ACPAs水平具有相关性,当ACPAs从血浆中清除时,抗NETs抗体的活性也降低[15]。反过来,ACPAs也能刺激中性粒细胞释放NETs,使炎症持续发生,形成恶性循环。此外,NETs形成过程中产生的与RA发病相关的自身抗原还有膜联蛋白A1、过氧化氢酶、基质相关蛋白酶8等。

2. 环境因素通过NETs诱导ACPAs产生促使RA发病:RA发病早期,一些环境因素如吸烟和牙周病感染都能以依赖PADs的方式形成NETs并产生瓜氨酸蛋白,进而诱导ACPAs产生[16]。随后,瓜氨酸化蛋白可与相应的自身抗体结合形成ICs,在ICs刺激下,关节滑膜炎性反应持续进展,最终导致关节组织破坏及畸形。NETs中的瓜氨酸蛋白产生后进一步诱导NETs的形成,形成正反馈。据报道,在健康吸烟者的支气管肺泡灌洗液中,PADs酶的表达和活性升高,瓜氨酸化蛋白水平也升高,可能与烟草中的尼古丁有关。一些临床证据表明,在RA亚临床和临床阶段,ACPAs阳性患者常伴有支气管扩张、间质性肺疾病和小气道阻塞等呼吸系统疾病[17]。牙龈卟啉单胞菌会引起牙周炎,并在高度血管化的环境中产生瓜氨酸抗原。放线菌团聚杆菌是一种革兰阴性杆菌,可引起牙周炎和感染性心内膜炎,通过产生白细胞毒素a来触发中性粒细胞整体高脂化,它也能够通过诱导ACPAs产生导致RA发生,但具体机制尚不明确[18]。

3. NETs通过促进滑膜成纤维细胞增殖和产生细胞因子加重RA关节损害:RA滑膜微环境非常有利于形成NETs。FLSs是促进关节滑膜增生的主要细胞,可吸引炎性细胞作用于滑膜,加剧关节炎症及组织破坏。NETs的瓜氨酸蛋白可作为自身抗原激活滑膜中的免疫细胞,刺激FLSs或巨噬细胞表达和释放IL-8、IL-6和IL-25等促炎性细胞因子,这些炎性细胞因子和多种抗体又可以诱导NETs产生,导致机体免疫耐受丧失,促进RA的发展。RA-FLSs可将NETs内化至晚期糖基化终产物受体-TLR9途径中。这种由FLSs内化的NETs可使FLSs合成更多的促炎性细胞因子和趋化因子,并通过主要组织相容性复合体Ⅱ使FLSs具有抗原递呈细胞能力[19]。FLSs可以将含有瓜氨酸肽的NETs递呈给RA抗原的特异性T细胞并激活它们,从而介导适应性免疫反应。研究表明,NETs在体外能促进RA-FLSs增殖并使RA-FLSs内CTGF mRNA表达上调和MST1激酶表达显著下调[20]。Khandpur等[13]研究结果表明,NETs对FA-FLSs的影响可能与RA患者滑膜中DNaseⅠ活性受损有关。

4. NETs介导RA发展的其他可能机制:除了上述机制外,NETs还可通过产生PAD2、排出线粒体DNA(mtDNA)、促进血管新生和血管翳的形成、激活补体系统等加剧RA炎症。NETs中的PAD2不仅可以直接降解滑膜中的软骨成分,还能激活FLSs和巨噬细胞的促炎途径,从而加剧关节损伤。目前,大多数研究者认为,NETs有细胞核及线粒体两种来源,但仍未进一步明确。NETosis期间,中性粒细胞排出的mtDNA具有促炎特性,这一发现增加了NETs介导的自身免疫的复杂性。由于mtDNA含有细菌核酸的残体,且存在异常甲基化,因此,机体可能产生对mtDNA的免疫反应,增强TLR信号和放大炎症信号而诱发RA[21]。RA滑膜中明显增多的NETs可以促进血管新生,但这一过程的分子机制有待于进一步研究。此外,NETs结合相关抗体后,可通过经典途径激活补体系统进一步加重炎性反应[22]。

三、以NETs为靶点在RA中的潜在疗法

NETs在RA发病早期发挥了重要的促炎作用,多种药物可通过调控NETs靶点治疗RA。研究表明,托珠单抗和利妥昔单抗等能通过减少NETs的生成延缓RA进展[23]。雷公藤不仅可以减少健康人和RA患者的NETs,还能通过抑制氧化爆发和脾酪氨酸激酶的活化阻止丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶、活化核转录因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)的磷酸化减少NETs中组蛋白的瓜氨酸化,从而延缓RA进展。另外一些研究表明,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)可以通过阻断T淋巴细胞mTOR受体阻止NETs的形成和ROS的释放降低RA等自身免疫性疾病的活动性。PAD4抑制剂CL-脒(CI-amidine)可通过减少小鼠关节和血清中的瓜氨酸蛋白和IL-6减轻关节损害,但效果欠佳。DNaseⅠ可促进NETs的清除从而减轻小鼠肾脏组织损伤并延长寿命。GSK199作为一种低钙PAD4酶抑制剂也可减缓关节炎严重程度。由此可见,靶向中性粒细胞产生的NETs可能成为改善RA患者预后的新的治疗靶点,针对其产生机制有望开发新的靶向药物。

四、展 望

中性粒细胞及其产生的NETs大量存在于RA的炎症部位,在自身免疫反应的发生和发展过程中起着至关重要的作用。RA的发生、发展与NETs生成能力的增加以及导致持续性炎症和组织损伤的NETs清除障碍有关。NETosis会导致细胞内翻译后修饰的蛋白质和DNA暴露,从而打破自身免疫耐受并激活适应性免疫反应,诱导免疫细胞产生自身抗体和细胞因子等,并直接激活邻近细胞,诱导组织损伤并导致全身炎性反应,促使RA发生。NETs还可以通过激活补体途径等方式放大炎性反应。本研究概述了可用于预防NETs生成或增加其降解的可能靶向药物,但仍需要对这些药物进行更多的研究和临床试验以证实其疗效,从而减轻对RA患者的伤害。进一步探索NETs影响RA的发病机制将为NETs成为具有诊断意义的生物学标志物和靶向NETs治疗RA提供坚实的基础。