哺乳动物免疫球蛋白基因及其表达机制研究进展

陶晓钊，薄欣宇，段树楠，任战军，董响贵，王淑辉

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西咸阳 712100）

免疫球蛋白是有颌脊椎动物在体液免疫过程中由B 淋巴细胞分泌的关键效应分子，用来进行有效的识别和清除抗原。在高等脊椎动物中免疫球蛋白重链基因呈“易位子”形式排列，其基因座由VH 基因片段，DH 基因片段和JH 基因片段以及下游的多种不同类型的CH 基因线性排列。C 区氨基酸序列稳定，用于决定Ig 的类型[1]，哺乳动物有5 种Ig 重链基因：μ、δ、γ、ε 和α，两种轻链基因：κ、λ，不同重链与轻链组成完整Ig的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD 和IgE[2]。

为了应对环境中种类繁多的病原，保护机体免受病原体的侵害，机体必须产生多样性的抗体来抵御复杂多变的抗原。有研究表明，人体可以利用有限的基因组针对抗原产生无限多种类的抗原受体[3]。在探究动物免疫球蛋白基因的整个进化过程中，研究人员需要解决的关键问题是，各种机制如何产生免疫球蛋白V 区库，以及C 区如何多样化以产生。免疫球蛋白V 区多样性产生机制包括V（D）J 重组（V(D)J recombination）[4]、体细胞超突变（Somatic hypermutation，SHM）[5]和基因转换（Gene conversion，GC）[6]。在过去的几十年里，人们对小鼠和人类的免疫球蛋白基因进行了深入的研究，我们对抗体多样性产生和其他相关分子机制的理解也获得近一步深入。然而，在牛中出现的超长CDR3的结构，兔中发现了IgD编码基因缺失的现象，骆驼中发现了仅由重链组成免疫球蛋白[7]，这些是在人类和小鼠的研究中没有发现的，说明不同的动物可能会利用不同机制来实现免疫调节。因此需要对哺乳动物的免疫球蛋白基因及其多样性机制进行更加深入的探究，了解不同动物的免疫机制过程，从而清楚其抗病机理，为提高其抗病力研究提供一定的参考。

1 猪免疫球蛋白基因及其表达机制

猪抗体重链和轻链的基因的编码方式与其他正常哺乳动物相同。有大约30 个VH基因且其核苷酸相似性大于75%，属于同1 个基因家族，2个功能性DH基因和1 个功能性JH基因，14～60 Vκ 基因，5 Jκ 片段、12～13 个功能性Vλ基因和两个功能性Jλ基因[8]，猪的Ig 基因只在CDR区域存在差异。在核酸表达水平上，7 个VH片段，2 个有功能性DH基因和1 个JH片段共同参与90%以上的VDJ重组[9,10]。下游有编码Cμ、Cδ、Cγ、Cε和Cα基因。猪IgH基因座的定位显示只有2 个功能性DH和1 个功能性JH，表明V(D)J重组对猪的VH基因库贡献甚微[11]。通过研究新生仔猪VDJ转录本的分子特征发现，CDR3的连接多样且不对称，D-J连接比V-DJ连接贡献更高的多样性。阅读框架II 的使用频率是框架III 的两倍，CDR3的多样性是通过重链不同基因片段的连接引入许多N-核苷酸的插入，从而产生不同长度的CDR[11,12]。

与其他物种不同，猪在蛋白质水平上具有平衡的λ 链和κ 链比率（分别为52%和48%）[13]。在其基因座的研究上也发现了相同的比例，在两个轻链基因座上都观察到了数量相似的功能性Vλ和Vκ基因[14]。猪λ基因座可以鉴定出22 个Vλ基因，其中只有9 个具有功能。至于κ 位点，有一个Cκ前面有5 个Jκ 片段，虽然可以识别出14 个Vκ 基因，但其中只有9 个是功能性的，因此与功能性Vλ基因的数量相同[15]。由于V 基因片段和J 基因片段数目有限，猪免疫球蛋白轻链V 无法同重链一样利用CDR3中的连接多样性，主要利用的是SHM。SHM 可以使有限的免疫基因产生多种的抗体来应对不同的抗原。SHM 主要的作用方式是在V 区引入点突变，其他方式有使碱基插入或者缺失[16]。研究发现，SHM 多发生在V(D)J重组区和J 基因片段下游内含子处，在其他位置发生的频率很低[17]。

2 牛免疫球蛋白基因及其表达机制

与人类和小鼠一样，牛表达5 类IgH 链：μ、δ、γ、E和α。但与人类中存在的4 个IgG 亚类（γ1、γ2、γ3和γ4编码）和两个IgA 亚类（α1和α2编码）相比，在牛中只发现了三个γ基因（γ1、γ2和γ3）和一个α基因[18,19]，且牛δ基因的存在直到2002 年才得到证实[20]。此前的研究一直认为，牛免疫球蛋白重链基因在第21 号染色体上[21]和第11 号染色体上[22]，且都具有功能性。Ma 等[23]通过原位杂交等实验发现，所有功能性牛IGH基因位于BTA21上，并且在BTA11上仅存在截短的μCH2外显子。在某种程度上，不同物种蛋白质水平上的λ/κ 比率被认为是基因组中V 基因数量最多的链的反映[24]。对牛基因组进行测序和注释，牛κ 基因位点紧凑简单，可能是因为牛优先使用λ 链。牛免疫球蛋白λ 轻链恒定区（IGLC）基因的序列分析表明，牛免疫球蛋白λ轻链基因座由四个连接恒定基因重组单元组成，长度约为20kb。重组信号序列的详细检查表明四个连接恒定基因重组单元的RNA 剪接位点和编码 序 列 中，只有两个IGLC基因（IGLC2和IGLC3）具有功能，而IGLC1和IGLC4似乎是假基因，也说明了在这四个基因中，IGLC3优先在牛中表达[25]。基于牛基因组分析确定了25 个功能性Vλ，但只有是8 个功能性Vκ 基因，而轻链中，牛优先使用λ 链（96%）[26]。

除经典的V(D)J 重组、体细胞超突变和基因转换等抗体多样性产生机制外，牛还具有利用超长CDRH3产生抗体多样性的机制。根据编码序列的长度和身份，在基因座中鉴定的23 个IGHD片段可以分为9 个亚组（称为IGHD1至IGHD9）。除了IGHD9 的两个成员（大小为14nt）外，所有其他功能性IGHD片段的长度都超过30 nt，其中IGHD8基因（149bp）最长。这些非常长的种系IGHD片段在牛中产生异常大的H 链CDR3长度变异性中起着关键作用[27]。超长CDRH3基因链是牛抗体多样性产生的一个独特机制。牛的超长的CDRH3区产生机制是通过不同的数量和位置的二硫键作用来获得大量的抗原结合构型[28]。

3 羊免疫球蛋白基因及其表达机制

通过Vlambda Vkappa 和V（H）cDNA 克隆的序列分析评估绵羊抗体库，尽管在Vkappa 链的连接区域发生了有限的多样性[29]，但所有胚系免疫球蛋白链基本上都属于种系结构。绵羊有9个VH片段，按照氨基酸序列相似性划分为同一IGHV1家族[30]。绵羊基因组包含60～90 个Vλ基因，分布在至少六个不同的家族中[31]。绵羊在VλcDNA 的CDR3区域中发现了显着差异的长度多态性。从FR1到FR3的一些cDNA 序列相同，但它们的CDR3长度各不相同。CDR3的长度变化不太可能是由某个随机过程产生的[32]，其在所有发育阶段的免疫球蛋白可变区均有表达，但是表达的偏好性有所不同，JH1 具有更强的表达偏好性[33]。

山羊免疫球蛋白轻链VJ重组时对V 基因的利用存在偏好性，λ 链中主要表达Vλ2和Vλ3，κ 链主要表达Vκ2和Vκ4[34]。山羊免疫球蛋白基因参与VDJ重组的主要是VH2，DH1和JH1基因片段，而N-核苷酸和P-核苷酸的插入是CDR3多样性的重要因素[35]，但是VDJ重组多样性机制对于构建山羊抗体库的作用的比较小，SHM 在山羊免疫球蛋白重链可变区表达谱多样性中是更为重要的机制[36]。山羊IgH位点存在于7个基因组支架上，包含10 个VH，3 个DH和6个JH段[37]。VH根据序列相似性将基因分为两个基因家族，体细胞超突变引入的点突变是这些表达可变区中存在的主要突变。与人和马相比，DH-DH融合在山羊V(D)J 重组中发生频率更高。这些结果为山羊免疫球蛋白重链可变区域基因组位点和库多样性提供了不同的见解。

4 骆驼免疫球蛋白基因及其表达机制

驼科动物是唯一能产生功能性重链抗体的哺乳动物。在1990 年代初期，在骆驼科动物中发现了其免疫系统中存在非常规抗体：以天然没有轻链的同源二聚体形式存在，因此这种抗体被称为仅重链抗体[38]。骆驼科血清同时含有常规杂四聚体抗体和独特的功能性重链抗体（HCAb）。这些同源二聚体抗体的H 链由1 个抗原结合结构域VHH（Variable domain of camelid heavy chain antibodies）和2 个恒定结构域组成。HCAbs由于第一恒定结构域的缺失和VHH 侧的重塑表面而无法结合轻链，这通常与常规抗体中的L 链相关。组成HCAb 的遗传元件已被鉴定，但这些抗体从其专用基因到抗原特异性和亲和力成熟的真正的抗体的体内生成仍然存在很多的未知机制[39]。在骆驼体内，重链抗体IgG2和IgG3占总IgG的75%，且IgG3相较于IgG2铰链区较长，其中重链抗体IgG2和IgG3由于供体剪接位点的点突变，缺少H链（CH1）的第一个恒定结构域。将重链抗体的可变区进行分离获得的短肽被称为纳米抗体，纳米抗体在疾病免疫机制中发挥重要作用，具有一定的研究价值[40]。

5 兔免疫球蛋白免疫球蛋白基因及其表达机制

在大多数哺乳动物中，IgD通常是1 种具有1 个或多个铰链结构域的三结构域分子，有时还有一个开关结构域。然而，在家兔中，IgD完全缺失，其基因组缺失了编码恒定区Cδ的基因序列，因此，家兔IgH只有四种CH基因类型[41]。Cγ基因在其他大多数哺乳动物中以多拷贝和亚型的形式存在，而家兔的IgH位点中仅有一个拷贝。相反，通常其他物种中只有一个Cα基因，而家兔则有多达13 个Cα基因，其中10 个被检测到能够表达出来[42]。通过测定兔Cμ基因座下游13.5 kb 基因组DNA 的核苷酸序列，没有在该区域找到兔子C delta 基因座，但发现该区域的重复元素密集分布[43]。家兔所有的VH基因片段的核苷酸序列相似性较大，属于一个基因家族[44]，在90%的表达谱中都使用VH1片段[45]、4 个DH和JH4基因片段[46]。

兔κ 轻链基因家族的特点是存在两个恒定区（Cκ）基因，其中Cκ1基因编码主要是免疫球蛋白轻链的恒定区，Cκ2基因则在家兔中不表达或表达极少[47]。κ 轻链存在两种同型形式且其表达水平存在很大差异。通常情况下，κ1的表达水平很高，而κ2几乎是沉默的，其原因是κ2基因座中缺少3′ 增强子所以出现κ1同种型被优先利用的现象[48]。然而在Cκ2基因下游约7kb 处发现了一个强大的增强子活性区域，该区域的序列在兔、人和小鼠之间高度保守[49]。

虽然VH、DH和JH基因片段的有限使用会导致VDJ重排有限，但由于N-核苷酸的插入，V(D)J基因重排产生的多样性结果比预期要大得多。

6 小结

通过对不同哺乳动物免疫球蛋白机理进行分析，发现不同物种可能使用不同的机制来实现相似的功能，例如：骆驼科动物只有重链的免疫球蛋白分子结构，以及牛利用超长CDR3来实现免疫球蛋白的多样性，这表明动物免疫球蛋白基因及表达机制具有极高的多样性。与人类和小鼠相比，上述哺乳动物的免疫球蛋白胚系可变区基因库都相对较小，未来的研究还需要完整地探究不同动物的免疫球蛋白基因座以及这些物种中多样化的作用机制，以达到了解物种进化历程，以及为分子抗病育种提供理论支持。