羊的胚胎移植技术要点

2023-02-08吴瑛，吴萍*

中国畜禽种业 2023年8期

吴瑛，吴萍*

（1.毕节市畜牧兽医科学研究所，贵州毕节 551700；2.贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司，贵州赫章 553200）

胚胎移植运用在加速家畜的繁育进程的同时可以保证生产性能，其商业化应用已有30 年之久。羊的胚胎移植是指将供体羊进行超数排卵配种后回收早期胚胎，移植到同一品种生理状况相近的另一只受体体内继续妊娠产生后代羔羊的技术。该技术以“借腹怀胎”的方式，达到增加良种后代的目的，以胚胎冷冻保存的方式，对优良畜禽遗传资源进行保护，为更好地进行遗传资源保护和开发利用提供了技术支撑。提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体[1]。胚胎移植最早应用于牛的繁育工作，羊的胚胎移植起步晚、发展慢。我国羊的胚胎移植应用始于20世纪后期，于1980 年在绵羊上首次应用成功[2]。进入21 世纪，中国农业大学[3]、内蒙古家畜改良站[4]等单位相继报道，胚胎移植的妊娠率达56%，产羔率达46%，开启了我国胚胎移植商业化应用的时代。近年来，关于胚胎移植在羊的生产应用中的研究增多，集中在超排处理、移植妊娠率、胚胎冷冻保存等方面，为该技术的推广及产业化夯实了基础。本文从供受体羊的选择与管理、移植季节选择、药物和器械准备、手术方法选择、冲胚及移植过程、胚胎冷冻保存、影响因素及应用前景等方面进行了详细综述，以期为开展胚胎移植实践提供参考。

1 供受体母羊的选择

1.1 供体母羊的选择原则

供体羊的选择，是开展胚胎移植应用的首要环节，影响胚胎移植的效果。在实际生产中，供体母羊受遗传价值、健康状况、既住繁殖史、年龄和胎次、体质体况等因素的影响，一般2～4周岁的经产母羊较为合适[5]。供体母羊要提前选择，群体数量要大以保证有足够的数量供选择，确保观察的发情周期准确，调整膘情到七成以上，不宜过肥或过瘦。若供体母羊在哺乳期内，最好是在羔羊断奶30d 后再选择，断奶之后加强补饲，尽量恢复到配种体况。

1.2 受体母羊的选择原则

对受体母羊的选择，不需要考虑遗传性能、种用价值等遗传因素，但要注重健康状况、繁殖性能等生理因素，只要符合能适应当地气候环境、繁殖性能好、母性强、无传染性疾病和膘情在七成以上条件即可。生产中，尤其注意要节省试验和生产成本，尽量不选择优质种羊。

1.3 供受体羊术前管理

供受体羊在接受胚胎移植手术前，需做好供体羊的饲养管理工作。一是要保持饲养环境稳定，避免出现较大的应激；二是要提供合理的日粮及青干草，保持一定的膘情，过度肥胖会影响发情；三是要提供清洁、卫生的饮水，保证健康，确保试验期间羊只不生病；此外，还要做好羊群的数据登记，建立胚胎移植数据库，做到科学、精准管理供受体羊，最好做到供受体羊群单独饲养管理，不混群。

1.4 胚胎移植季节的选择

研究表明，品种、光照、温度等均能影响羊的发情周期，大部分绵羊品种为季节性发情，少数为常年发情[6]。在每年的秋季，母羊的卵巢机能开始活跃，卵泡发育成熟，表现出发情特征；在春夏冬等季节，母羊的卵巢机能基本处于静默状态，卵泡不发育，不表现发情和排卵[7]。因此，选择适宜胚胎移植的季节，要根据气候变化、羊的发情状况等综合考虑，最好是选择羊的繁殖季节开展，这样效率最高。但有时候，为了配合幼畜超排技术，加快繁育进程，则要强制在每年5 月份前后开展胚胎移植。

1.5 供体羊输精的选择

供体羊的输精工作是使精卵结合形成胚胎开展后续移植工作的前提。一般而言，供体羊撤栓12h 后将试情公羊放入羊群进行试情，根据反应判断发情情况，然后将发情母羊标记、隔离。配种可以采用两种方式：自然交配（人工辅助交配）和人工授精。前者较为简单，将公母羊合群后，观察爬跨行为，登记即可，但要注意配后间隔8h 最好再复配1 次，直到母羊不接受爬跨为止。人工授精可以采用传统人工授精或腹腔镜人工授精技术。腹腔镜人工授精技术是指借助腹腔镜授精可以将精液直接送入母羊子宫角内，该方法可以克服传统输精方法由于母羊子宫颈管道构造特殊，精子不易通过所导致的情期受胎率低的问题，大大提高了受胎率，但最好也间隔12h 再输精一次。

1.6 药品及手术器械的准备

在胚胎移植工作中使用的药物，必须保证产品可靠，有效成分含量准确，经试验表明性能稳定，并且按照药物运输和保存要求的条件妥善运输和保存[8]。主要药物和器械分类整理如下：收卵器械包括冲卵管、肠钳套乳注射器、胶管、带硅胶管的16 号针头、集卵杯、烧杯；检卵设备包括体视显微镜、六孔杯、回收管、二氧化碳气体、培养箱、带硅胶管的7 号针头、平底蒸发皿、显微操作仪及附件；移植手术时还需要各种手术器械包括毛剪、外科剪、刀片、外科刀、创巾钳、活动刀柄、手术镊、缝合线、止血钳、持针器、缝合针、创巾若干、手术保定架、紫外灯、高压消毒锅；所需药品及试剂包括促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，FSH）和孕马血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、普鲁卡因、肾上腺素及止血药品、2%静松灵、纱布、药棉、抗生素及其他消毒液、生理盐水等[9]。

2 超数排卵与同期发情

2.1 超数排卵原理

超数排卵是指在母羊发情周期的任一时间，对母羊注射外源激素，如FSH 和PMSG 等，使处理羊的血液中促性腺激素浓度升高，从而降低早期发育卵泡的闭锁率，使成熟卵泡的数量增加，从而排出比自然发情情况下更多的卵细胞[10]，超数排卵是获得大量胚胎的基础。

2.2 超数排卵方法

目前，最常采用的超排处理方法是一是“阴道孕酮栓+PMSG+FSH”法，如郭振刚等[11]在贵乾半细毛羊上的研究表明，采取“埋置海绵孕酮栓+PMSG”法进行同期发情及递减法注射FSH进行超数排卵处理及自然交配后，手术法在子宫角回收供体胚胎，结果10 只供体共计获得胚胎106 枚，可利用胚胎73 枚，平均冲胚达10.60 枚/只，平均可用胚胎7.30 枚/只，胚胎合格率达68.87%，试验结果达到国内同类研究的平均水平。其次是两次前列腺素（Prostaglandin，PG）+FSH 法，在发情周期的任意一天，对供体羊注射第一次PG（定为第0 天），观察记录第2～3天的发情情况，对能够明显观察到发情情况的供体母羊从第11 天开始注射FSH，每日2 次，注射剂量逐级递减，3d 后再注射一次PG。

2.3 受体羊的同期发情

同期发情是使受体羊处于与供体羊同一生理基础的先决条件，发情生理情况越接近，胚胎移植后的受胎率就越高[12]。如王玉琴等[13]研究，采用2～12h 的扩展囊胚进行移植，妊娠率可达94.74%。这是因为胚胎只能移植到与之发育要求相适应的受体生殖环境中，才能继续发育。因此若要采用鲜胚进行移植，在供体超排的同时，必须对受体进行同期发情处理，使之生殖生理状态与供体同步化。而在选择冻胚移植时，只需考虑移植的季节性，且在秋季移植可增加妊娠率[14]。

3 供体羊手术冲胚检胚以及受体羊的手术移植

3.1 手术

术前准备。超排前供受体母羊禁食至少24h，术前2h 禁水。

保定。使用胚胎移植手术架躺卧式保定，将四肢固定在手术架上，防止母羊手术过程中剧烈活动。

备皮处理。羊只保定麻醉后，用肥皂水浸湿乳房周边直径约10cm 的肚腹，用刮毛刀或刀片刮净羊毛，注意不要划伤皮肤，再使用毛巾擦拭干净皮肤，最后用酒精喷洒消毒，覆盖手术创巾，以创巾钳固定四角，推进手术室静待手术。

手术。手术时，在乳静脉与腹中线之间，用手术刀切开皮肤及筋膜，倒过手术刀，以钝头分离腹直肌或前拉腹直肌，显露腹股沟管处，在腹股沟管处剪开或手术刀钝头直接破开以显露腹腔。切口不宜过大，否则影响缝合和愈合，也不能过小，过小不方便取出子宫而对子宫造成刺激或损失，适宜大小为1.5～2cm 宽。腹腔暴露后，伸进食指和中指在骨盆腔、膀胱周围触摸子宫，然后轻轻勾住子宫体，将卵巢、子宫拉出，查看黄体位置并记录。

3.2 冲胚

冲胚方法可分为输卵管法、冲卵管法和子宫法，生产中多采用输卵管法和子宫法。

输卵管冲胚法：操作时，将冲卵管一端从输卵管伞部喇叭口插入6～8 号头皮针，插入2～3cm 深处，打活结或用钝圆夹子固定，另一端接集卵器，用注射器吸取37℃冲卵液5～10mL，在子宫角靠近输卵管部位，将针头朝输卵管方向扎入。一人操作时，一只手的手指在针头后方捏紧子宫角，另一只手推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵器。此种方法的优点是卵的回收率高、冲卵液用量少、检卵省时，缺点是容易造成输卵管伞部粘连[15]。

子宫角冲胚法：在供体羊发情授精后6～7d采卵，将子宫暴露，用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，用注射液吸入冲卵液20～30mL，将冲卵针头（套管针）从子宫角尖端插入。插入时确认针头在子宫角宫腔内，连接注射器，缓缓注入冲卵液。当子宫角膨胀时，立即将回收卵针头从肠钳基部的上方迅速插入，引导冲卵液收集于集卵杯内。相同方法对另一侧子宫进行冲卵。进针时避免损伤血管。该法的优点是子宫角冲卵法对输卵管损伤较小，主要用于超排母羊发情后的5.5～6d，从子宫可以收集到桑椹胚至扩展囊胚，此时的胚胎可用于移植、冷冻或其他研究等，但该方法的胚胎回收率较低。

3.3 胚胎评定

鉴别可用胚胎和不可用胚胎是进行下一步胚胎移植的关键，只有发育良好的胚胎才能用于移植，否则会严重影响移植受胎率。在收集冲胚液后，最好在20min 内将其放置在显微镜下观察，同时使用检胚细管将获取的胚胎移入新鲜培养液中，以保持胚胎活性。通常，以胚胎形状，分裂球大小，卵裂球变形以及均匀度与透明带间隙等项目对胚胎质量进行分级鉴定。一般来说，可用胚胎的卵裂球轮廓清晰、球体圆滑又饱满，而不可用胚胎表面不光滑、有毛边且不圆。2 细胞的胚胎，卵裂球轮廓清楚、球体饱满、透明度适中鉴定为1 级；1/3 卵裂球死亡的鉴定为2 级；1/2卵裂球死亡鉴定3 级；其余定为4 级[16]。只有1、2、3 级胚胎可用于移植。

3.4 移植

胚胎移植可采用手术法和腹腔镜法。

手术法，在掏出子宫和卵巢后，查看黄体发育状况，在黄体侧，用钝形针头在子宫角穿孔，将移植管沿子宫角方向插入宫腔，注射胚胎，随即轻轻复位子宫，缝合皮肤。胚胎移植时，原则上将来自输卵管的胚胎移入输卵管，来自子宫角的胚胎移入子宫角的前1/3 处。

腹腔镜法，借助腹腔镜找到子宫，再将胚胎移植针从另一侧插入腹腔，将胚胎注射到相应位置。该方法操作简便，但是需要一定的经验。

3.5 缝合

创口缝合按照外科手术操作的原则进行。缝合过程中不得触碰其他无关物品。操作时要细心、迅速，不让子宫体长时间暴露。切忌多次、用力拉扯子宫。胚胎移植后，仔细检查移植器中是否有胚胎遗漏，确认无遗漏后方可缝合。手术创口缝合采用两层缝合法，缝合内肌层和皮肤，缝合肌肉层后撒适量青、链霉素粉，以防止创口感染，缝合皮肤后用碘酒消毒处理。

3.6 术后受体的饲养管理

胚胎移植后的受体，注意观察并精心护理，定期查看是否返情。若发现受体发情，要做进一步的观察和检查。在移植后45d 左右，可采用兽用B 超进行早期妊娠诊断。对已妊娠的受体分群管理，预防流产，同时补充营养全面的饲草料，既要保证胎儿的正常发育，又要避免发育过度而引起难产。此外，还要根据当地疾病发生情况，及时接种相应疫苗，让胎儿提前获得免疫能力。

4 影响胚胎移植效果的因素

4.1 受体品种

受体羊选择，在胚胎移植中具有至关重要的作用。研究表明，不同品种用作受体羊移植单胚时，妊娠率和胚胎成羔率均无差异，但是移植双胚胎时，胚胎妊娠率和胚胎成羔率有显著差异[17]。

4.2 移植胚胎数量

赵霞等[18]报道，移植2 枚和3 枚胚胎时山羊的妊娠率显著高于移植1 枚的。黄承俊等[19]研究也表明，移植2、3 枚胚胎的妊娠率明显高于移植1 枚胚胎时的妊娠率。实际生产中，应根据羊的品种、体型大小及获得的有效胚胎数量等来确定最佳移植数量。

4.3 采胚方法

研究表明，输卵管法平均采集可用胚数高于子宫角法，但是子宫角法采集的胚胎具有更高的妊娠率和产羔率，是理想的采胚方法[20]。腹腔镜技术可缩短单次移植时间，减少手术损伤，利于动物健康，在加速胚胎移植的产业化应用中则更为广泛。

5 胚胎移植技术的应用前景

作为最实用的高效繁育技术，胚胎移植可以结合优秀公羊和优秀母羊的品种优势，同时作为人工授精技术的延伸，将在家畜品种培育和改良中得到广泛应用。一方面，通过人工授精充分发挥良种公羊的配种能力，另一方面，胚胎移植还可以获得优良母羊的生产性能，这对羊的高效繁育具有重要意义。随着整个胚胎移植技术体系的不断进步，其产业化应用也将近一步得到发展。