猕猴桃抗菌肽截短体原核表达载体的构建

李 蒙

(西安文理学院 生物与环境工程学院，西安 710065)

由于一直以来传统抗生素的过度使用，已经引起细菌耐药性发生改变，从而在世界范围内引起严重的健康问题，寻找新型有效抗菌药物变得越来越重要.动植物等生物类抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)是一类具有抗菌活性的低分子量短肽，大多数是由阳离子和疏水性残基组成的双亲性分子[1].其能快速且有效地对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丝状真菌和原生生物以及包膜病毒在内的微生物起到杀伤效果，因此被称为“自然抗生素”[2].大多数抗菌肽是通过静电作用和疏水作用吸附于细菌的细胞膜，破坏膜结构使其内容物外漏，发挥杀菌活性，抗菌肽独特的作用机制使细菌很难通过改变细胞膜成分对其产生抗药性[3]，因此，抗菌肽也被称为天然防腐剂，可以抑制致病菌的繁殖，且其自身热稳定性好，安全无毒害，在食品工业中其防腐和保鲜方面具有广阔的应用前景[4].

近些年来，猕猴桃市场前景可期，但也存在一些问题.猕猴桃成熟与采摘过程中病虫害等外部因素，导致损失率大，现在部分针对猕猴桃溃疡病、软腐病、褐斑病等病害的防治技术[5-7]以化学防治为主，防治效果有限，并会产生部分化学药品残留，潜在影响猕猴桃果实的品质.目前在食品工业中抗菌肽中乳铁蛋白、蛙皮素、乳酸链球菌素(Nisin)等已被广泛应用于防腐保鲜领域，Nisin可抑制乳酸菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌等的生长，在肉和鸡蛋类食品中有良好的防腐保鲜效果[8-10].开发环保无公害、成本合理、操作方便等优点的天然防腐保鲜剂，是抗菌肽研究工作的重点.

围绕陕西省“十四五”科技发展规划部署的重点任务和产业重大科技需求，聚焦解决“卡脖子”问题，开展猕猴桃病虫害防治、收储加工运输环节中保鲜剂的研发与应用，本实验室前期已经构建了pET-47b(+)-Fa-AMP抗菌肽原核表达载体[11]，在此基础上，本研究拟通过基因重组技术获得pET-47b(+)-Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽的重组载体及原核表达菌株，为后续抗菌肽在果蔬保鲜方面的功能研究奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

原核表达载体pET-47b(+)-Fa-AMP、大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α均由本实验室保存.

1.2 试剂

BamH I和SacⅡ核酸限制性内切酶，DNA分子量 Marker；Taq PCR Mastermix；DNA纯化试剂盒；质粒提取试剂盒.

1.3 抗菌肽基因设计及合成

根据NCBI数据库中抗菌肽(accessionPSS14603.1)蛋白质序列分析，截取93个氨基酸进行密码子优化及合成(上海生物工程有限公司)TrAMP核苷酸序列(5’-ATGTCTCTGCGTGGCAAACTGCCGCTGCTGGCTCTGCTGCTGGCTCTGGTTTTCGTTCTGG CTTCTGTTGCTTTCGGCGCTGCTGAATGGAACGACGGCAGCCCGGAAAAACGTCTGCGTGAATGCCAGCAGCGTTGCGACCGTCACGAACAGCGTGAAGAACGTGAAGACTGCCAGCGTCGTTGCCTGGAAGACTACCGTCGTGAAAAAGAAGAACGTGGCGGCCGTGCTGAAGAAATCACTCCGCACCACAAAGGCCGTGAAGAAGAAGAAAAAGAA-3’).

1.4 融合抗菌肽基因的表达载体构建

根据公司优化后合成的TrAMP核苷酸序列，设计扩增引物，利用Vector NTI软件设计上下游引物F1(5’-ACTGCCGCGGGGATGTCTCTGCGTGGC AAACTG-3’，下划线为SacⅡ酶切位点)，R1(5’-ACTCGGGATCCTTCTTTTTCTT CTTCTTCAC-3’，下划线为BamH I酶切位点)引物，采用PCR法获得目的基因.PCR反应体系(25 μL)：F1，R1引物各1 μL，2xTap酶 Mix 12.5 μL，ddH2O 17.5 μL，模板0.5 μL.PCR程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循环30次；72 ℃终延伸10 min.反应结束后使用1.0 %琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析，产物使用纯化试剂盒进行纯化后置于-20 ℃保存.使用核酸限制性内切酶对纯化的PCR产物和原核表达质粒pET-47b(+)进行双酶切，酶切后构建重组真核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过pET-47b(+)载体通用引物T7上游引物(5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’)，T7下游引物(5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)对Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽基因扩增验证，PCR反应体系(25 μL)、程序和检测方法同目的基因方法相同.

1.5 序列比对分析及抗菌活性预测

利用ExPASy在线进行蛋白质等电点及分子量预测(https://web.expasy.org/protparam/)；在NCBI数据库中进行BLASTP序列比对；二级结构预测采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html)；空间结构预测采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive).抗菌活性预测在数据库DBAASP(https://dbaasp.org/tools?page=special-prediction)中进行分析.

2 实验结果与分析

2.1 融合抗菌肽基因的克隆与载体构建

对截短体抗菌肽TrAMP基因的PCR扩增产物，使用1.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析，由图1可见，250～500 bp间有特异性条带，符合预期结果，再将其连接到表达载体pET-47b(+)-Fa-AMP中，载体上通用引物PCR扩增鉴定，结果表明与实验预期的Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽基因大小一致，测序表明融合抗菌肽的原核表达载体构建成功.

图1 抗菌肽基因的PCR扩增

M.DL2000.1、2、3、7、8、9.Fa-AMP基因的PCR扩增结果；4、5、10、11.Fa-AMP+TrAMP基因的PCR扩增结果；12、13、14.TrAMP基因的PCR扩增结果；0、6.杂带.

2.2 生物信息学分析与抗菌活性预测

序列在NCBI数据库中比对，结果显示氨基酸序列一致，在线软件预测融合抗菌肽分子量为16.368 kD，等电点为6.50，为不稳定蛋白，通过SOPMA对Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽进行二级结构预测，结果表明，其二级结构中α螺旋所占比例为47.95%，β转角所占比例为8.22%，无规则卷曲所占比例为41.78%，延伸链所占比例为2.05%.说明其蛋白的二级结构以β折叠和无规则卷曲为主.利用在线ExpASy的SWISS-MODEL对其进行三级结构预测显示是多肽的无规则卷曲.选取融合抗菌肽功能域的氨基酸序列对大肠埃希菌，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等7种细菌进行活性预测，结果表明其对肺炎克雷伯菌有抑菌活性(表1).

表1 抗菌活性预测结果

注：阳性预测值(positive predictive value,PPV)表示预测为活性肽；阴性预测值(negative predictive value,NPV)表示为非活性肽.而对人红细胞活性的评价，非活性肽被认为是阳性，以PPV表示).

3 讨论

截至目前，多种抗菌多肽和蛋白质已经在不同生物中被发现并得到分离，数百种抗菌肽的结构已得到确定，抗菌肽数据库也已经极大扩展[12-13]，抗菌肽基本上具有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体的作用，并且几乎抗菌肽没有致畸作用且不发生蓄积中毒[14].抗菌肽分子量一般小于10 kD，由15～50个氨基酸残基组成，多数含有较多正电荷氨基酸并且长度、序列和结构多样的双亲性多肽，可以杀死革兰氏阴性和阳性细菌、真菌、病毒及癌变的细胞[15].抗菌肽可以选择作用于病原微生物，作用微生物时可以有多个靶标，从而减少耐药性[16]，抗菌肽具有分子小、水溶性好、稳定性高等特点，在机体内最终被酶解为氨基酸，无残留毒性，被作为新型抗菌剂应用于医药[17]、食品工业[18]等领域.

抗菌肽可以直接从微生物、植物和动物体中提取分离，但是直接提取对工艺要求高，难度大[19].因此，通过分子生物学技术合成人工抗菌肽是高效制备的理想选择.因此，本实验选取猕猴桃抗菌肽部分序列，其中包含预测的功能结构域(a-C-X-X-X-C-(10-12)X-C-X-X-X-C)序列，进行基因合成与载体重组，成功构建了表达载体pET-47b+Fa-AMP+TrAMP，并通过生物信息学模型预测显示融合抗菌肽具有抑菌活性，为抗菌肽的高效制备及其结构与生物活性功能的研究奠定了基础.

对于AMP及其生物功能预测有助于了解其作用机理，为开发设计更有效与稳定的活性抗菌肽提供理论依据.目前经验分析优化抗菌肽方法是通过蛋白质序列、理化性质、抗菌性及溶血性等参数分析及进行分子设计，通过计算机构建抗菌肽模型，挖掘生化特性与抗菌活性之间的线性与非线性关系，都是基于抗菌肽序列优化与生化特性研究[20-22]，其存在诸多不足，比如优化后的抗菌肽不稳定、易降解、制备难度大、抑菌效果差等，亟待进行大量试验进行验证与分析.本研究通过两种抗菌肽序列的重组，优化抗菌肽技术路线，有助于特定情况下有针对性地改变氨基酸残基、调节疏水性、重塑构象和多肽柔韧性，为抗菌肽改造与应用提供合理选择的方案和理论支持.