饲粮中添加壳寡糖对犬营养物质表观消化率、抗氧化能力和肠道菌群的影响

2023-02-08杨晓斌李瑞国石柏灌杨慧超高巧仙李荣林辛国省

动物营养学报 2023年1期

杨晓斌李瑞国妥强石柏灌杨慧超高巧仙李荣林辛国省*

(1.宁夏大学农学院，银川 750021;2.宁夏饲料工程技术研究中心，银川 750021;3.宁夏大学生命科学学院，银川 750021;4.宁夏昊标检测服务研究院，银川 750021;5.佩蒂动物营养科技股份有限公司，温州 325405)

随着经济的发展、人类生活水平的提高和人口老龄化问题的加剧等，宠物犬的需求大幅度增加。传统的犬粮可能会造成宠物犬肥胖、糖尿病、结石等代谢疾病的频繁发生，严重威胁犬的健康。因此，功能性食品开发对犬的生长、健康以及养殖有着重要的意义。壳寡糖(chitooligosaccharide,COS)，学名为寡糖，又名葡萄糖胺寡糖，由2～10个氨基葡糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖[1]。由自然界中广泛存在于节肢动物和昆虫的外骨骼以及真菌细胞壁中的甲壳素[2]、几丁质[3]与壳聚糖[4]不同程度地脱乙酰和水解得到。COS具有水溶性、无细胞毒性、易被肠道吸收等特点[5]。Walsh等[6]研究发现，饲料中添加COS能显著提升仔猪营养物质表观消化率并显著提高肠道乳酸菌的数量，并显著降低大肠杆菌的数量。苏维发等[7]研究发现，生长育肥猪饲粮中添加COS能显著增强机体的免疫功能。齐敬宇等[8]研究发现，COS可抑制脂多糖诱导奶牛外周血单个核细胞的抗氧化酶活性。温佳颖等[9]研究发现，COS对肠道致病菌有良好的抑制作用。Osho等[10]研究表明，添加1 g/kg的COS能提高地塞米松胁迫下肉鸡的营养物质表观消化率和抗氧化能力。Zhang等[11]研究发现，泥鳅饲料中添加COS能显著提高血清抗氧化酶与肠道消化酶的活性且添加量由1 g/kg增加到5 g/kg时肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性呈先增后降的趋势。除此之外，COS还具有抗菌[12]、抗肿瘤[13]、抗炎[2]等多种生物学活性。在医学[14]、食品[15]、农业[16]等领域中得到了较为广泛应用。目前国内外对COS在宠物上的相关研究报道较为罕见。因此，本研究基于COS的良好应用前景，以1～2岁成年雄性泰迪为对象，旨在探究不同添加量下的COS对成年犬营养物质表观消化率、免疫力与抗氧化能力的影响及对肠道菌群的调节作用，评价其对宠物犬的益生作用，确定COS的适宜添加量，为COS在犬功能性食品的科学应用提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

COS，聚合度为2～10，分子质量≤2 000 Da，脱乙酰度90%，纯度80%。

1.2 试验动物与试验设计

试验选用1～2岁、体重[(5.64±0.26 ) kg]相近的成年雄性泰迪试验犬18只(犬只来自宠物犬养殖场)，采用单因子完全随机试验设计，随机分为3组，每组6个重复，其中对照组饲喂基础饲粮，不添加COS，COS1组在每千克基础饲粮中添加1 g的COS，COS5组在每千克基础饲粮中添加5 g的COS。试验期45 d，其中预试期15 d，正试期30 d。

1.3 试验饲粮

参照NRC(2006)[17]犬猫营养需要、成年犬维持营养需要量配制基础饲粮，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.4 饲养管理

试验犬采用单笼饲养，自由饮水。试验开始前对犬笼全面清洗、消毒，对试验犬按常规程序进行防疫、驱虫。试验期间定期对试验场所进行清扫，消毒。于每天08：00、16：00进行饲喂，饲喂量按年轻成年试验犬每日维持代谢能需要[ME(MJ/d)=140×BW0.75/239]确定。

1.5 样品采集

1.5.1 粪样采集

试验结束前7 d采用全粪法收集粪样。挑拣毛发及杂物，将每天收集的粪便样本称重后，取总量的10%，装入自封袋中，加10%的硫酸混匀后置于-20 ℃冰箱冷冻保存。待粪样收集完成后，将7 d的粪样混匀，于105 ℃烘干，冷却后粉碎，过40目筛，装入样品袋保存，待测。

1.5.2 血样采集

试验最后1 d采用臂前静脉采血。用不含抗凝剂的5 mL采血管采集血样4 mL，2份。室温静置30 min，将采血管放入离心机内，4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min，取上清装于1.5 mL离心管，保存于-80 ℃备用。

1.5.3 肠道内容物等样品采样

在试验最后1 d，用无菌直肠棉拭子经生理盐水湿润后旋转插入肛门，收集粪便，插入无菌冻存管内，放入液氮罐中保存，用于肠道菌群结构检测。

1.6 指标测定

1.6.1 营养物质表观消化率的测定

测定指标包括干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)和磷(P)，其含量按照杨胜[18]主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》中的方法进行测定。营养物质表观消化率的计算公式如下:

营养物质表观消化率(%)=[(营养物质的摄入量-营养物质的排出量)/营养物质的摄入量]×100。

1.6.2 血清生化指标的测定

将制备的血清送于宁夏迪安乐嘉医学检验中心(有限公司)进行血清生化指标的测定，主要指标包括干扰素-γ(IFN-γ)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)与总蛋白(TP)的含量。

1.6.3 血清抗氧化指标的测定

将制备好的血清送往宁夏昊标检测服务研究院，进行血清抗氧化指标的测定。指标包括总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量。

1.6.4 肠道菌群的测定

将冻存管中的粪样置于干冰中，送于北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16SrDNA V3～V4区测序和生物信息学分析。

1.7 数据统计与分析

利用Excel 2021软件进行数据初步整理，采用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分(one-way ANOVA)，并进行Duncan氏法多重比较，结果以平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 COS对犬营养物质表观消化率的影响

由表2可知，与对照组相比，饲粮中添加1 g/kg的COS对各营养物质表观消化率均无显著影响(P>0.05)，添加5 g/kg的COS显著增加了犬对EE的表观消化率(P<0.05)，对其他营养物质表观消化率无显著影响(P>0.05)。

表2 COS对犬营养物质表观消化率的影响Table 2 Effects of COS on apparent digestibility of nutrients of dogs %

2.2 COS对犬血清抗氧化能力的影响

由3表可知，与对照组相比，饲粮中添加COS显著提高了血清T-AOC(P<0.05)且COS5组显著高于COS1组(P<0.05)，其中COS1组较对照组提升了23.48%，COS5组较对照组提高了37.95%，COS5组较COS1组提高了18.35%；饲粮中添加COS对血清GSH-Px与SOD活性及MDA的含量没有显著影响(P>0.05)。

表3 COS对犬血清抗氧化能力的影响Table 3 Effects of COS on serum antioxidant capacity of dogs

2.3 COS对犬血清生化指标的影响

由表4可知，与对照组相，饲粮中添加1 g/kg的COS对犬血清生化指标均无显著影响(P>0.05)，添加5 g/kg的COS显著增加了犬血清总蛋白的含量(P<0.05)，对其他血清生化指标无显著影响(P>0.05)。

表4 COS对犬血清生化指标的影响Table 4 Effects of COS on serum biochemical indices of dogs

2.4 COS对犬肠道菌群结构的影响

2.4.1 测序数据的处理、序列聚类及物种注释情况

基于Illumina Nova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端(paired-end)测序。通过对reads拼接，平均每个样品测得102 703条tags，经过质控，平均得到98 209条有效数据，质控有效数据量达65 074，质控有效率达63.39%，结果如表5所示。以97%的一致性(identity)将序列聚类成为操作分类单元(OTUs)，共得到1 393个OTUs，然后对OTUs序列与Silva138数据库进行物种注释。注释结果中，共有671个(48.17%)OTUs注释到属水平。

表5 测序数据预处理Table 5 Preprocessing of sequencing data

2.4.2 Alpha多样性指数

对不同样本在97%一致性阈值下的Alpha多样性分析指数进行统计分析。由表6可知，各组粪便菌群测序覆盖均在0.999以上，说明得到的OTUs序列对于试验结果具有代表性。各组间Observed species、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数差异不显著(P>0.05)，说明饲粮中添加COS对犬肠道菌群组成的物种丰富度和物种多样性无显著影响。

表6 Alpha多样性指数Table 6 Alpha diversity indexes

2.4.3 物种多样性曲线

以抽取的测序数据量与对应的物种(OTUs)数来构建组别稀释曲线图，如图1所示。以OTUs的排序编号与OTUs中的相对丰度绘制成等级聚类曲线，如图2所示。由图1可知，各组在测序量为1 000时出现明显转折，曲线均趋于平缓，说明测序深度已满足试验需求。由图2可知，各组OTUs中的相对丰度在10-4以下时，曲线趋于平缓，说明测序数据量已趋于合理，物种分布比较均匀。

2.4.4 物种分布情况

2.4.4.1 门水平粪便菌群结构组分分析

选取各组在门水平上相对丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图。如图3所示，本试验条件下，犬粪便菌群相对丰度前10的菌群由梭杆菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、未鉴定菌门(unidentified_Bacteria)、脱氧杆菌门(Deferribacteres)、螺旋体门(Spirochaetota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、绿湾菌门(Chloroflexis)组成。由表7可知，相对丰度大于1%的优势菌群有5个：梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门。占主导地位的物种有梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门，占前10物种总体的90%以上。在门水平，与对照组相比，添加COS均显著降低了犬肠道放线菌门的相对丰度(P<0.05)且COS5组显著低于COS1组(P<0.05)；此外，添加5 g/kg的COS显著提高了厚壁菌门的相对丰度(P<0.05)。对照组与试验组之间绿湾菌门的相对丰度差异不显著(P>0.05)，但COS1组显著低于COS5组(P<0.05)，相对于COS5组降低了83.33%。

表7 门水平相对丰度Table 7 Relative abundance of phylum levels %

横坐标为从某个样本中随机抽取的测序条数，纵坐标为基于该测序条数能构建的OTUs数量，用来反映测序深度情况，不同组用不同颜色的曲线表示。The horizontal coordinate is the number of sequencing lines randomly selected from a sample,and the vertical coordinate is the number of OTUs that can be constructed based on the number of sequencing lines to reflect the sequencing depth.Different groups are represented by curves of different colors.图1 稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve

2.4.4.2 属水平粪便菌群结构组分分析

选取各组在属水平上相对丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图。如图4所示，犬粪便中属水平相对丰度前10的菌群有：梭菌属(Fusobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、艰难梭菌属(Peptoclostridium)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、布劳特氏菌属(Blautia)、普氏菌属(Prevotella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、副杆菌属(Parabacteroides)、柯林斯氏菌属(Collinsella)。由表8可知，占主导地位的主要有梭菌属、拟杆菌属，占前10物种的50%左右。在属水平，与对照组相比，添加COS均显著降低了犬肠道拟杆菌属和柯林斯氏菌属相对丰度(P<0.05)且柯林斯氏菌属相对丰度在COS5组显著低于COS1组(P<0.05)。其中COS1组拟杆菌属相对丰度较对照组降低了37.93%，COS5组较对照组降低了35.42%，COS1组柯林斯氏菌属相对丰度较对照组降低了55.50%，COS5组较对照组降低了97.25%且COS5组相较于COS1组降低了93.81%。

表8 属水平相对丰度Table 8 Relative abundance of genus levels %

横坐标为按OTUs丰度排序的序号，纵坐标为对应的OTUs的相对丰度，用来反映样本中物种的丰富度和均匀度，不同的组用不同的颜色的折线表示。The horizontal coordinate is the serial number sorted by OTUs abundance,and the vertical coordinate is the relative abundance of corresponding OTUs,which is used to reflect the richness and evenness of species in the sample.Different groups are indicated by broken lines of different colors.图2 等级聚类曲线Fig.2 Rank abundance curve

Fusobacteriota:梭杆菌门；Firmicutes:厚壁菌门；Bacteroidota:拟杆菌门；Actinobacteriota:放线菌门；Proteobacteria:变形菌门；Unidentified_Bacteria:未鉴定菌门；Deferribacteres:脱氧杆菌门；Spirochaetota:螺旋体门；Acidobacteriota:酸杆菌门；Chloroflexi:绿湾菌门；Others:其他。图3 门水平物种相对丰度Fig.3 Relative abundance of phylum level species

Fusobacterium:梭菌属；Bacteroides:拟杆菌属；Lactobacillus:乳杆菌属；Peptoclostridium:艰难梭菌属；Alloprevotella:拟普氏菌属；Blautia:布劳特氏菌属；Prevotella:普氏菌属；Phascolarctobacterium:考拉杆菌属；Parabacteroides:副杆菌属；Collinsella:柯林斯氏菌属；Others:其他。图4 属水平物种相对丰度Fig.4 Relative abundance of genus level species

3 讨论

3.1 COS对犬营养物质表观消化率的影响

营养物质表观消化率是反映动物对饲粮中营养物质消化吸收的重要指标[19]，能反映营养物质的消化吸收状况，也可反映饲粮营养是否平衡[20]。Huang等[21]研究发现，饲粮中添加COS能够显著提高肉鸡干物质、钙、磷、粗蛋白质和所有氨基酸的回肠表观消化率。Harikrishnan等[22]研究发现，饲粮中添加COS具有提升鲢鱼消化酶活性的作用。本研究发现，添加5 g/kg的COS对犬粗脂肪表观消化率有显著的提升效果，说明犬饲粮中添加5 g/kg COS对犬脂质代谢有很好的改善作用。除此之外，犬饲粮中添加COS对干物质、粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷表观消化率作用在统计学上虽然没有达到显著差异，但均较对照组有一定程度的增加，并且对干物质、粗蛋白质、粗脂肪和磷的表观消化率的作用随COS添加量的增加呈现有规律的增强趋势。这可能与COS刺激犬胃、肠黏膜促进消化酶的分泌作用，进而促进了犬对各营养物质的吸收有关。

3.2 COS对犬血清抗氧化能力的影响

动物机体抗氧化能力与机体的健康有着密切的联系。Xie等[23]研究表明，妊娠猪饲粮中添加COS可以显著提高妊娠母猪血浆SOD的活性。Osho等[10]研究表明，地塞米松胁迫下雄性肉鸡饲粮中添加1 g/kg的COS能显著增加血浆中SOD与GSH-Px的活性。Chang等[24]研究发现，饲粮中添加COS能显著降低黄羽肉鸡肌肉中MDA含量并增加肌肉SOD和GSH-Px的活性。Qi等[25]研究发现，COS能够增加硫代乙酰胺诱导的肝性脑病(HE)Wistar大鼠肝脏组织中GSH-Px表达并降低MDA含量。Zhang等[11]研究发现，泥鳅饲料中添加1与5 g/kg的COS均能显著增加泥鳅血清SOD、GSH-Px的活性。在本试验中，饲粮中添加COS显著增加了犬血清T-AOC，并且5 g/kg组显著高于1 g/kg组。在机体防御体系中，T-AOC的作用主要是维持内环境活性氧的动态平衡，清除过高的活性氧，使机体处于氧化还原相对稳定的状态，代表体内酶类和非酶类抗氧化物的总体水平，能全面反映动物机体的抗氧化状态[26]。有研究表明，COS清除自由基的能力会随着COS添加量的提高而增强，可能是由于COS分子中的铵根离子提供的单电子是清除自由基的根源。而饲粮中添加COS对犬血清SOD、GSH-Px活性及MDA的含量无显著影响，说明COS对机体抗氧化功能的影响作用可能与COS添加量以及试验动物有关。

3.3 COS对犬血清生化指标的影响

血清生化指标可以反映动物机体的免疫功能与健康状况[27]。Katiyar等[28]研究发现，COS能降低糖尿病小鼠血清低密度脂蛋白、葡萄糖、胆固醇和甘油三酯含量。Xu等[29]在建立的小鼠肉瘤180肿瘤模型中，使用100 mg/kg COS能显著提高小鼠血清中IFN-γ的含量。本研究发现，饲粮中添加5 g/kg的COS显著增加了犬血清总蛋白的含量，对血清其他指标均无显著影响。血清总蛋白作为机体蛋白质代谢的重要指标，为白蛋白和球蛋白的总和[30]。本研究结果中，虽然各组之间血清白蛋白和球蛋白含量差异未达到显著水平，添加COS血清白蛋白和球蛋白含量均有所提高，这可能与COS提高了犬对蛋白质的消化率有关，并且球蛋白与机体的免疫密切相关，这说明COS一定程度上提升了犬的代谢功能和免疫力。连国琦等[31]研究发现，环江香猪饲粮添加0.5%的COS能显著提升血浆碱性磷酸酶的活性，对其他血清生化参数均无显著影响。这说明COS对动物机体生化指标的影响也与COS的添加量和试验动物有密切关系。

3.4 COS对犬肠道菌群结构的影响

肠道菌群能够调节动物机体代谢、免疫等功能，影响机体的生长及健康状况。肠道菌群结构受到宿主遗传、饮食、生活环境、年龄、健康状况、药物等影响[32]。肠道菌群的结构和数量在一定范围处于动态平衡状态。肠道菌群异常改变可能会导致肥胖、糖尿病和自身免疫性疾病以及神经精神疾病[33]。对粪便菌群分析可以准确地反映肠道菌群的变化。本试验通过高通量测序技术，对18只泰迪犬新鲜粪便菌群测序分析。结果显示，各组菌群丰富度Observed species、Chao1、ACE指数与菌群多样性Shannon、Simpson指数均无显著差异，说明添加COS对犬的肠道菌群结构丰富度、多样性没有显著效果。

本试验从门、属2个水平对饲粮中添加COS的犬肠道菌群结构与多样性的变化进行了分析。在门水平，犬肠道中的优势菌门有梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门与变形菌门，这与陆江等[34]的研究结果相同。本研究发现，添加5 g/kg的COS显著增加了厚壁菌门的相对丰度。厚壁菌门是人与多种哺乳动物中的优势菌门，与机体肠道屏障的保护功能有关[35]。Fábrega等[36]报道，厚壁菌门的比例与胃肠道炎症呈负相关。Wang等[37]报道，COS对肠道健康有积极作用，能有效保护炎性肠病(IBD)的肠道屏障。因此，犬饲粮中添加5 g/kg的COS能增加犬的肠道抗炎和肠道保护作用。也有研究发现，厚壁菌门相对丰度与动物肠道中脂肪、蛋白质的消化有关，具有促进饲粮营养消化吸收的作用[38]。这与本试验中添加不同水平的COS促进了犬对粗蛋白质、粗脂肪的表观消化率的结果一致。在属水平，犬饲粮中添加COS显著降低了犬肠道中柯林斯氏菌属的相对丰度。Astbury等[39]报道，柯林斯氏菌属与非酒精性脂肪肝、肥胖和动脉粥样硬化有关，并且表明该微生物属中存在的一些途径可能影响宿主的脂质代谢。这表明饲粮中添加COS可能有降低犬非酒精性脂肪肝、肥胖和动脉粥样硬化的风险。除此之外，饲粮中添加COS对犬肠道放线菌门、绿湾菌门与拟杆菌属的作用可能与COS增强犬代谢、改善犬肠道内环境的作用有关。