博落回水提取物对大肠杆菌攻毒断奶仔猪生长性能、腹泻指数和肠道健康的影响

2023-02-08黎育颖田军权苏文璇包学太

动物营养学报 2023年1期

杨凡黎育颖田军权苏文璇包学太姚康

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所，动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，湖南省畜禽健康养殖技术研究中心，长沙 410125；2.中国科学院大学，北京 100049)

仔猪断奶阶段至关重要，早期断奶是提高现代生猪养殖体系效率的关键措施之一，但这也会给仔猪带来生理、心理等方面的压力，随之产生的应激表现为厌食、肠道结构和功能损伤、腹泻及抵抗能力低下等[1-3]。与此同时，断奶仔猪由于本身消化道和免疫系统发育并不完全，在应激状态下更容易感染致病菌而进一步损伤肠道结构和功能，出现或者加重呕吐、腹泻等症状，这都会危害仔猪健康，提高仔猪死亡率，造成巨大的经济损失[4-5]。产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是导致仔猪腹泻的致病因子之一，可通过食物、饮水及粪便等途径传播，严重危害仔猪健康。大肠杆菌进入仔猪肠道后开始繁殖，在达到一定数量后，开始分泌黏附素，并在黏附素的帮助下定植在肠上皮，随即分泌肠毒素、水肿病毒素、内毒素和溶血素等毒性物质，破坏肠道黏膜完整性和功能，引起仔猪腹泻、呕吐、炎症和水肿[6-7]。使用抗生素是以往防治仔猪多发性腹泻的重要手段之一，但有研究证明，长期使用抗生素，会导致细菌耐药性增强、药物残留、环境污染以及公共安全隐患等问题[8]，而且我国农业农村部也颁布了禁止饲料生产企业生产含有促生长类药物的商品饲料的法规。因此，寻找新型天然无公害的抗生素替代物势在必行。

博落回(Macleayacordata)是罂粟科、博落回属多年生草本植物，主要分布于我国及欧洲和北美洲一些国家。博落回富含异喹啉生物碱，包括血根碱、别隐碱、原碱、白屈菜红碱、氧血根碱、二氢白屈菜红碱和二氢血根碱[9]，其中血根碱和白屈菜红碱是其主要有效成分，具有促进生长、缓解炎症、调节肠道菌群、增强免疫力、抑菌和灭虫等作用[10-12]。据报道，血根碱和白屈菜红碱的抗菌抗炎症能力出色。Kosina等[13]报道，血根碱和白屈菜红碱能够很好地抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌及无乳链球菌。在改善炎症方面，血根碱通过抑制核因子-κB(NF-κB)通路相关基因的活化和p65的核转移来缓解仔猪小肠黏膜上皮细胞的炎症反应[14]。Niu等[15]研究表明，白屈菜红碱同样改善了二甲苯引起的小鼠耳部炎症反应。博落回提取物近些年也被应用于动物生产中，饲粮添加120 mg/d博落回提取物可以改善仔猪的生长性能，提高养分表观消化率[16]；饲粮添加30 mg/kg博落回提取物能够显著提高白羽肉鸡的平均日增重和平均日采食量，并增强其抗氧化能力和抗炎能力[17]；此外，在荷斯坦犊牛饲粮中添加400和800 mg/kg的博落回提取物均能改善其生产性能，提高养分表观消化率及免疫机能[18]。然而，博落回水提取物对大肠杆菌感染仔猪的生长性能、腹泻、肠道形态以及肠道炎症等方面的影响的研究，尚未见报道。因此，本试验将博落回水提取物添加到断奶仔猪饲粮中，旨在探究博落回提取物对ETEC攻毒仔猪生长性能、腹泻、肠道形态以及肠道炎症的影响，为博落回提取物在断奶仔猪腹泻上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的博落回水提取物是以博落回叶为原料，经过破碎、加热煎煮和蒸发浓缩等步骤后得到的自制品，其实血根碱实测含量为43.25 μg/mL。本试验所用的ETEC是由购买于国家菌种保藏中心的ETEC K88冻干粉[编号：VIP(S)24607]培养得到，ETEC K88冻干粉通过复苏、传代增菌后得到试验所需的大肠杆菌浓度。

1.2 试验设计和饲养管理

试验选取28日龄健康的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪30头[体重(8.22±0.98) kg]，随机分为3个组，每组10个重复，每个重复1头猪。3组分别是对照组、模型组和试验组，其中对照组和模型组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮的基础上添加1 mL/kg(参考以往试验结果得到)的博落回水提取物。基础饲粮参照NRC(2012)营养标准配制，其组成及营养水平见表1，饲粮营养水平根据NRC(2012)数据库计算所得。预试期3 d，正试期18 d。在正试期第15天，模型组和试验组每只试验猪灌胃10 mL浓度为2×109CFU/mL的ETEC K88菌液，对照组灌胃同一剂量的无菌LB培养液。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

续表1项目Items含量Content乳清粉Wheypowder2.63葡萄糖Glucose3.00大豆油Soybeanoil3.00L-赖氨酸盐酸盐L-Lys·HCL0.80蛋氨酸Met0.46苏氨酸Thr0.40色氨酸Try0.10磷酸氢钙CaHPO41.20石粉Limestone0.50氯化钠NaCl0.30预混料Premix1)1.00合计Total100.00营养水平Nutrientlevels2)消化能DE/(MJ/kg)14.69粗蛋白质CP16.99可消化赖氨酸DLys1.54可消化苏氨酸DThr0.95可消化蛋氨酸DMet0.86可消化色氨酸DTrp0.25钙Ca0.78总磷TP0.64有效磷AP0.42

本试验在中国科学院亚热带农业生态研究所动物房进行，试验场地实行封闭管理，试验猪只单笼饲喂，试验期间自由采食和饮水，定期进行猪舍卫生打扫和消毒。

1.3 样品采集

在试验第18天，各组试验猪进行12 h禁食但自由饮水，然后对猪只进行前腔静脉采血，随后将猪只处死并解剖；分离空肠和回肠，使用生理盐水冲洗肠道1～2遍，去除内容物后，剪为2～3 cm肠段用锡箔纸包好后，迅速放入液氮中保存，用于制作肠道切片。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 生长性能

试验期间记录每日每头仔猪的采食量，并且在试验期第1、14以及18天时相同时间点称量猪只体重，计算各组仔猪的平均日采食量和平均日增重，并计算料重比。计算公式如下：

平均日采食量=总采食量/试验天数；平均日增重=(终末体重-初始体重)/试验天数；料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.4.2 腹泻指数

每日定点对仔猪的腹泻情况进行观察并记录，判定腹泻标准为4个等级，即正常(粪便成形，颗粒适中)、轻度(粪便松散部分成形，湿润且颗粒较大)、中度(半液体粪便，水分较高但无粪水分离)和重度(液体状粪便，水分极高且粪水分离)腹泻，分别得到0、1、2和3分。采用腹泻指数展示腹泻情况，腹泻指数越高代表腹泻越严重。

腹泻指数=腹泻评分/供试猪只总数。

1.4.3 肠道形态

取空肠和回肠组织样本，使用4%多聚甲醛溶液固定，切片制作、观察、肠道绒毛高度和隐窝深度测量以及绒隐比(绒毛高度/隐窝深度)计算等具体方法详见文献[19]。

1.4.4 肠道免疫功能

采用实时荧光定量PCR测定空肠和回肠免疫相关基因白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-12β(IL-12β)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA相对表达量，具体方法参考Fu等[20]，各目的基因的mRNA相对表达量采用2-△△Ct法计算，基因引物序列见表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.5 数据统计分析

试验数据先使用Excel 2019软件进行初步处理，再使用SPSS 26.0对相关指标进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并使用Duncan氏法进行多重分析，结果数据以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著，0.05

2 结果与分析

2.1 博落回水提取物对断奶仔猪生长性能的影响

由表3可知，第1～14天(攻毒前)，对照组和模型组断奶仔猪终末体重、平均日采食量和平均日增重以及料重比之间均无显著差异(P>0.05)；与对照组相比，试验组断奶仔猪终末体重和平均日采食量略有提高，但差异不显著(P>0.05)，平均日增重显著提高了33.33%(P<0.05)，料重比显著降低了27.24%(P<0.05)。第15～18天(攻毒后)，与对照组相比，模型组断奶仔猪终末体重、平均日采食量和平均日增重略有降低，料重比略有提高，但差异均不显著(P>0.05)；与模型组相比，试验组断奶仔猪终末体重、平均日增重和料重比差异均不显著(P>0.05)。整个试验期间(第1～18天)，与对照组相比，试验组断奶仔猪终末体重、平均日采食量和平均日增重差异均不显著(P>0.05)，但料重比有降低趋势(P=0.089)。

表3 博落回水提取物对断奶仔猪生长性能的影响Table 3 Effects of Macleaya cordata water extract on growth performance of weaned piglets

2.2 博落回水提取物对断奶仔猪腹泻指数的影响

由表4所示，第1～14天(攻毒前)，3组断奶仔猪腹泻指数之间差异不显著(P>0.05)。攻毒后24 h，与对照组相比，模型组断奶仔猪腹泻指数显著提高(P<0.05)，试验组腹泻指数略有升高，但差异不显著(P>0.05)；与模型组相比，试验组腹泻指数略有降低，但差异不显著(P>0.05)。攻毒后48 h，与对照组相比，模型组断奶仔猪腹泻指数显著提高(P<0.05)；与模型组相比，试验组腹泻指数显著降低(P<0.05)。

表4 博落回水提取物对断奶仔猪腹泻指数的影响Table 4 Effects of Macleaya cordata water extract on diarrhea index of weaned piglets

2.3 博落回水提取物对断奶仔猪肠道形态的影响

由表5可知，与对照组相比，模型组断奶仔猪空肠隐窝深度显著提高(P<0.05)，回肠隐窝深度略有升高，但差异不显著(P>0.05)，空肠绒隐比显著降低(P<0.05)，空肠、回肠重量和空肠绒毛高度差异不显著(P>0.05)。与模型组相比，试验组断奶仔猪空肠绒隐比、回肠绒毛高度和绒隐比显著提高(P<0.05)，空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，空肠重量和绒毛高度以及空肠重量和隐窝深度差异均不显著(P>0.05)。

表5 博落回水提取物对断奶仔猪肠道形态的影响Table 5 Effects of Macleaya cordata water extract on intestinal morphology of weaned piglets

此外，如图1所示，在感染ETEC后，模型组断奶仔猪回肠绒毛高度降低，空肠隐窝深度增加，病变损伤部位明显；而试验组、对照组与模型组相比，空肠和回肠绒毛高度高，隐窝深度低且无明显的组织损伤和坏死。

图1 断奶仔猪回肠和空肠形态结构Fig.1 Morphological structure of ileum and jejunum of weaned piglets

2.4 博落回水提取物对断奶仔猪肠道免疫功能的影响

由表6可知，与对照组相比，模型组断奶仔猪空肠IL-1β的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)，空肠IL-18、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量均略有提高，但差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，试验组断奶仔猪空肠IL-18、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量均略有降低，空肠IL-1β的mRNA相对表达量略有提高，但差异均不显著(P>0.05)。与模型组相比，试验组断奶仔猪空肠IL-18、IL-8和IL-1β的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，空肠TNF-α的mRNA相对表达量有所降低，但差异不显著(P>0.05)。

表6 博落回水提取物对断奶仔猪空肠炎症因子表达的影响Table 6 Effects of Macleaya cordata water extract on expression of inflammatory factors in jejunum of weaned piglets

由表7可知，与对照组相比，模型组断奶仔猪回肠IL-17、IL-1β、TNF-α和IL-8的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)，试验组回肠IL-17、IL-1β、IL-8和IL-12β的mRNA相对表达量均有所降低，但差异不显著(P>0.05)。与模型组相比，试验组断奶仔猪回肠IL-17、IL-1β、TNF-α和IL-8的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，回肠IL-12β的mRNA相对表达量略有降低，但差异不显著(P>0.05)。

表7 博落回水提取物对断奶仔猪回肠炎症因子表达的影响Table 7 Effects of Macleaya cordata water extract on expression of inflammatory factors in ileum of weaned piglets

3 讨论

3.1 博落回水提取物对断奶仔猪生长性能的影响

断奶早期，仔猪受到营养、心理、生理和环境等方面的压力后易出现断奶应激，这会影响仔猪采食习惯的养成和胃肠消化道的发育，使仔猪腹泻，影响仔猪对营养物质的消化吸收和代谢，进而影响仔猪的生长。博落回制剂在以往的研究中展现了优良的促生长效果。王敏等[21]在仔猪饲粮中添加300 mg/kg的博落回散，结果发现博落回能够降低料重比，提高饲粮总能消化率，改善仔猪生长性能。同样，饲粮中添加50 mg/kg的博落回散能够使仔猪平均日采食量提高3.96%，平均日增重提高9.08%，料重比降低4.67%[22]。在本试验中，第1～14天(攻毒前)，饲粮中添加1 mL/kg的博落回水提取物能够显著提高断奶仔猪的平均日增重，显著降低料重比，这与上述研究结果接近。博落回提取物具有刺激仔猪肠道细胞分化，促进肠道发育，并进一步增加营养物质消化吸收的效果，这可能是博落回提取物改善断奶仔猪生长性能的机制[23]。另外，在攻毒后，与模型组相比，试验组断奶仔猪平均日增重和料重比均有改善趋势，这表明博落回水提取物能够缓解大肠杆菌感染导致的生长性能下降。博落回水提取物缓解大肠杆菌感染导致的仔猪生长性能下降主要是通过抑制大肠杆菌、改善仔猪腹泻实现的，其对大肠杆菌的抑制作用主要表现在2个方面：一方面，博落回水提取物可以抑制细菌里细胞动力学Z环(cytokinetic Z-ring)的形成，对FtsZ蛋白的装配进行干扰，从而抑制细菌的分裂[24]，减少大肠杆菌的繁殖；另一方面，博落回水提取物通过破坏大肠杆菌细胞膜使其失活，减少毒素的分泌，保护仔猪肠道结构，缓解腹泻，从而改善生长性能。综上所述，饲粮中添加1 mL/kg的博落回水提取物能够改善断奶仔猪的生长性能，并缓解由大肠杆菌感染导致的生长性能下降。

3.2 博落回水提取物对断奶仔猪腹泻指数的影响

仔猪断奶后，由于自身消化系统和免疫系统发育不完善，会出现生理性或病原性腹泻，大肠杆菌K88便是导致仔猪腹泻的致病因子之一。腹泻会严重影响仔猪的生长性能，提高仔猪死亡率，造成巨大经济损失。因此，降低仔猪的腹泻率是保证仔猪健康生长的重要手段。博落回提取物在以往研究中表现出能够缓解腹泻的效果。夏超笃等[24]研究表明，饲粮中添加0.1%的博落回提取物便可以显著降低断奶仔猪腹泻率。另外，王敏等[21]在断奶仔猪饲粮中添加300 mg/kg的博落回散后也显著降低了断奶仔猪的腹泻率。本试验与上述研究结果接近，攻毒后24 h，模型组断奶仔猪腹泻指数显著高于对照组，表明大肠杆菌攻毒建模成功；攻毒后48 h，试验组腹泻指数显著低于模型组，表明博落回水提取物缓解了大肠杆菌攻毒引起的仔猪腹泻。博落回水提取物能够缓解大肠杆菌攻毒引起的腹泻，可能与其抑制病原菌和调节肠道有益菌群丰度等功能相关[26]，表明博落回水提取物能够抑制大肠杆菌从而保护仔猪的肠道结构，减少大肠杆菌感染导致的肠道损伤和腹泻。Liu等[27]研究表明，博落回提取物降低了第14天生长猪的血浆D-乳酸和二胺氧化酶水平，这表明博落回提取物在一定程度上改善了肠道黏膜发育，增强了肠道屏障强度，提高了肠道保护能力，从而减少腹泻。此外，大肠杆菌感染仔猪肠道后造成的肠道炎症，也会导致仔猪腹泻。而博落回提取物中的血根碱作用于肠上皮细胞后能够缓解肠道炎症反应[14]，促进肠道健康，从而减少仔猪腹泻。综上所述，饲粮中添加1 mL/kg的博落回水提取物能够缓解大肠杆菌感染导致的仔猪腹泻，这可能与其抑制大肠杆菌、保护肠道结构和缓解肠道炎症相关。

3.3 博落回水提取物对断奶仔猪肠道形态的影响

正常的肠道结构是保证仔猪健康和快速生长的重要基础，仔猪出现断奶应激后会损伤肠道结构，出现肠绒毛萎缩、隐窝深度增加等问题，对消化、吸收、分泌和屏障功能造成影响[28]。此外，大肠杆菌感染也会损伤肠道结构[19]。肠道绒毛高度、隐窝深度以及绒隐比一般作为评判肠道吸收功能的重要指标。正常发育过程中，绒毛上皮细胞正常掉落，掉落的细胞从隐窝底部迁移、分化，然后成为成熟的绒毛细胞到绒毛末端，隐窝深度随即变浅，上皮细胞逐渐成熟，绒毛吸收能力增强[29]。但大肠杆菌感染会破坏这一过程。Chen[30]等研究表明，博落回提取物能够显著降低试验组断奶仔猪空肠隐窝深度，显著提高空肠和回肠绒隐比。这表明，在正常情况下，博落回提取物能够改善肠道形态结构。本试验采用大肠杆菌攻毒后发现，相较于模型组，试验组断奶仔猪空肠、回肠绒毛高度、隐窝深度以及绒隐比均有所改善，表明饲粮中添加博落回水提取物能够缓解大肠杆菌感染导致的仔猪肠道结构损伤。博落回水提取物改善大肠杆菌攻毒导致的仔猪的肠道结构损伤可能是通过抑制病原菌，使其失活或阻断其繁殖，进而减少毒素生成达到的。以往的研究表明，博落回提取物能够对肉鸡肠道有害菌进行有效的抑制，减少有毒物质生成，从而达到缓解肠道结构损伤的效果[31]；另外，博落回提取物还能够促进肠道细胞增殖分化[22]。博落回提取物使大肠杆菌失活后，又通过促进肠道细胞的增殖分化，加速损伤的肠道结构的更新修复，从而使试验组断奶仔猪肠道发育与对照组相比无显著差异。综上所述，饲粮中添加1 mL/kg的博落回水提取物能够改善大肠杆菌感染导致的断奶仔猪肠道绒毛高度下降和隐窝深度增加等问题。

3.4 博落回水提取物对断奶仔猪肠道免疫功能的影响

博落回提取物具有一定的抗炎效果，这可能与其中的血根碱和白屈菜红碱相关。血根碱能够抑制NF-κB激活，降低巨噬细胞TNF-α和一氧化氮水平，从而改善炎症[15]。另外，血根碱和白菜屈红碱均能够极显著降低巨噬细胞的单核细胞趋化蛋白-1和IL-6的mRNA表达量，且效果与抗炎药物泼尼松相似[32]。大肠杆菌感染仔猪肠道后会分泌有毒物质损伤肠道黏膜，并刺激促炎细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等的合成和分泌，破坏肠道免疫平衡，导致仔猪肠道出现炎症[33-34]。炎症因子表达量能够体现机体的炎症水平，适当的炎症反应是机体对抗病原体的正常过程，但过多表达会损伤机体。博落回提取物在以往的研究中展现了良好的抗炎效果。高欢等[14]研究表明，血根碱能够显著或极显著降低炎症模型仔猪小肠黏膜细胞的IL-6和IL-8等的mRNA相对表达量，缓解仔猪上皮黏膜细胞的炎症。另外，研究发现，博落回提取物能够通过下调肉鸡肠道促炎因子IL-1β的表达来改善肉鸡肠道炎症反应[35]；而且，博落回提取物还能够通过降低促炎细胞因子如迁移抑制因子、IL-8、IL-1β、干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α的表达量，并提高抑炎细胞因子IL-10的表达量，来改善轮状病毒引起的小鼠肠道炎症[35]。在本试验中，大肠杆菌攻毒提高了模型组断奶仔猪空肠IL-18、IL-8和IL-1β以及回肠IL-17、IL-1β、TNF-α和IL-8的mRNA相对表达量，表明大肠杆菌感染造成了肠道炎症；而博落回水提取物的添加显著降低了试验组断奶仔猪空肠IL-18、IL-8和IL-1β以及回肠IL-17、IL-1β、TNF-α和IL-8的mRNA相对表达量，表明博落回水提取物能通过降低肠道IL-18、IL-8、IL-1β、IL-17和TNF-α等炎症因子的表达，缓解肠道炎症。博落回水提取物本身的抗炎、抗菌特性是其发挥良好抗炎效果的基础，两者的协同作用促进了炎症的消退，但具体机制尚不明确，还需进一步探究。综上所述，饲粮中添加1 mL/kg的博落回提取物能够缓解大肠杆菌感染造成的断奶仔猪肠道炎症。