醋制商陆正丁醇部位降低肝肾毒性作用机制研究

丁 锐，王奎龙，沈梦丹，吴 鑫，吴国清 ，曹 岗*

1.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053

2.浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007

3.浙江省立同德医院，浙江 杭州 310012

4.浙江省中药新药研发重点实验室，浙江 杭州 310063

药物在发挥药效的同时，可能会产生一些不良反应，引起机体损伤，这种损伤称之为药物毒副作用，其中以药物的肝肾毒性最为常见。中草药肝肾毒性事件近几年来也引起越来越多的关注，如马兜铃酸引起的肾毒性[1]及何首乌引起的肝毒性事件[2]，给患者带来痛苦的同时也把中药的安全性问题推向了风口浪尖。在全球范围内，药源性肝损伤[3]是肝病学家面临的最具挑战性的肝脏疾病之一，中草药的肝肾毒性问题同样严重[4]，随着中药及其制剂在国内外广泛的应用，其安全性问题不容忽视[5]，否则将阻碍中药的现代化及国际化进程。中药炮制是一门传统的制药技术，可以达到增效减毒的作用[6-8]。峻下逐水类中药是一类临床常用的毒性中药，大多采用醋制法炮制减毒，如芫花二氯甲烷部位醋制后可降低其对大鼠肝肾细胞的氧化损伤[9]，商陆也是其中的代表之一。商陆为商陆科植物商陆Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陆P.amerrcanaL.的干燥根，具有逐水消肿、通利二便的作用[10]。商陆成分复杂，其毒性成分主要为商陆皂苷类成分[11]，该类成分具有肠道[12-13]、肝脏[14-15]及肾脏[16-17]毒性。目前对于商陆醋制减毒的研究大多集中在商陆的胃肠道刺激性方面，但对于醋制是否能够降低商陆的肝肾毒性却鲜有报道，本研究通过整体动物模型，对血清生化指标及组织病理切片的观察，明确醋制能否降低商陆的肝肾毒性，并进一步通过代谢组学的方法探究其醋制减毒的作用机制。

代谢组学是继蛋白质组学、转录组学后发展起来的围绕机体代谢的新兴组学[18]。目前代谢组学在中药以及药物毒性研究方面已有较多报道[19-21]，Dong 等[22]运用代谢组学方法评价天南星对大鼠的肾毒性，为中药毒性的动态和整体研究提供了一个有前景的工具。Luo 等[23]通过代谢组学的方法探讨栀子诱导的肝毒性的作用机制，发现胆汁酸代谢和氨基酸代谢紊乱与栀子产生肝毒性密切相关。代谢组学已发展成为中药研究领域一种常规的研究手段。本研究采用代谢组学的方法来研究商陆醋制降低肝肾毒性的作用机制，将为商陆醋制减毒机制的探索提供参考，为中药炮制减毒机制研究提供借鉴。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠50 只，3～5 周龄，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号SCXK（沪）2022-0004。动物饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，恒定温度湿度。动物实验经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会批准（批准号IACUC-20221017-14）。

1.2 药材

商陆购自安徽亳州市场，经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定为商陆P.acinosaRoxb.干燥根。

1.3 药品与试剂

小鼠营养饲料由浙江中医药大学实验动物中心提供；宁化府名特醋购自太原市宁化府益源庆醋业有限公司；羧甲基纤维素钠溶液（批号190710）购自上海展云化工有限公司；舒泰50（规格50 g/L，批号191123）购自法国维克贸易（上海）有限公司；盐酸赛拉嗪注射液（规格2 mL/支，批号200112）购自吉林省华牧动物保健品有限公司；10%福尔马林固定液（批号20210623）购自北京金克隆生物技术有限公司；石蜡（批号C12221754）购自上海麦克林生化科技有限公司；包埋盒购自江苏世泰实验器材有限公司；无水乙醇（批号20200831）购自广东光华科技股份有限公司；黏附载玻片（批号20082）、盖玻片购自江苏世泰实验器材有限公司；二甲苯购自上海凛恩科技发展有限公司；甲醇（批号211218）、乙腈（批号207025）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸（批号J1908039）、熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）对照品（批号128-13-2，质量分数≥98%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硬脂酸（批号S27A11X122357）、胆酸（cholic acid，CA）对照品（批号81-25-4）、鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）对照品（批号474-25-9）、石胆酸（lithocholic acid，LCA）对照品（批号434-13-9）、甘氨鹅脱氧胆酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）对照品（批号 640-79-9）、甘氨脱氧胆酸（glycodeoxycholic acid hydrate，GDCA）对照品（批号360-65-6）、牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）对照品（批号516-35-8）、牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholicacid，TUDCA）对照品（批号35807-85-3），以上均购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均≥98%；中性树胶（批号20230407）、去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）对照品（批号83-44-3，质量分数≥98%）购自北京索莱宝科技有限公司；牛磺脱氧胆酸（taurodeoxycholic acid，TDCA）对照品（批号516-50-7，质量分数≥98%）购自成都德思特生物技术有限公司。

1.4 仪器

Spring-S20 型纯水机（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）；Arcadia H 型石蜡包埋机、RM2255 型石蜡切片机（德国Leica 公司）；E200MV 型生物显微镜（南京尼康江南光学仪器有限公司）；Xevo TQ-S 质谱仪（美国Waters 公司）；真空离心浓缩器（德国Eppendorf公司）；3100 型全自动生化分析仪（日本日立公司）。

2 方法

2.1 药物制备

2.1.1 生品商陆正丁醇部位的制备 取生商陆10 kg，放置到提取罐中，加入8 倍量的70%乙醇回流提取2 h，残渣加入6 倍量70%乙醇回流提取1 h，重复上述操作，合并3 次提取液，减压浓缩，得醇浸膏。将商陆70%乙醇浸膏用适量水溶解，采用石油醚、二氯甲烷梯度萃取，最后加入4 倍量的水饱和正丁醇，多次萃取后，合并萃取液，回收溶剂，减压干燥得到正丁醇浸膏，则为生品商陆正丁醇部位。

2.1.2 醋制商陆正丁醇部位制备 取生品商陆片，加入米醋拌匀，闷润至透，置于炒锅内文火加热，炒干，即得醋制商陆（每100 kg 商陆，用醋30 kg[4]）。取醋制商陆，按“2.1.1”项下方法制备醋制商陆正丁醇部位，生品及醋制商陆正丁醇部位得率均为20%。

2.2 成分分析

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取生醋品商陆正丁醇部位提取物各1 mg，甲醇定容至1 mL，12 000 r/min 离心10 min，取上清待测。

2.2.2 色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱：0～8 min，18%～33% B；8～13 min，33%～90% B；13～20 min，90% B。柱温40 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样量1 μL。

2.2.3 质谱条件 采用ESI 离子源，数据全信息串联质谱（MSE）模式，正、负离子模式扫描采集，通过LockSpray 技术确保每个保留时间采集到准确的碎片信息。正、负离子模式毛细管电压3.5 kV；离子源温度150 ℃；去溶剂温度350 ℃；碰撞能量30～60 eV；MS1扫描时间为0.1 s，MS2扫描时间为0.01 s，采集离子范围为m/z50～2000。

2.3 动物分组及给药

小鼠适应性饲养1 周后，随机分为对照组及生品商陆低、高剂量（27、54 mg/kg）[24]组和醋品商陆低、高剂量（27、54 mg/kg）组，每组10 只。各给药组ig 相应药物，对照组ig 5% CMC-Na 溶液，1 次/d，连续28 d。

2.4 血清生化指标检测

末次给药后，使用舒泰50（70 mg/kg）联合盐酸赛拉嗪注射液（5 mg/kg）麻醉小鼠后取血，采集到的血液待低温静置并分层后，4 ℃、3000 r/min 离心20 min，取上层血清，采用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平。

2.5 肝、肾组织病理切片观察

小鼠脱颈椎处死后，用手术剪剪开小鼠的腹腔，取出两侧肾脏和肝脏，生理盐水清洗，吸除多余水分，浸泡于福尔马林溶液中。自来水清洗，肾脏组织用刀片对半切开后取一半，肝脏组织切取大叶上约3 mm 厚度，分别放入包埋盒中，自来水流水冲洗过夜，次日梯度乙醇脱水，浸于硬脂酸-石蜡（1∶1，56～58 ℃）30 min，然后浸于石蜡中40 min，使用包埋机包埋，待石蜡冷却后，去掉包埋槽，蜡块室温放置过夜。组织切片前，将蜡块放于-20 ℃冰箱40 min 以上，使用切片机切取病理切片约4 μm厚度置于载玻片上，60 ℃烘箱熔蜡1 h，进行苏木素-伊红（HE）染色，中性树胶封片，通风橱中挥发尽二甲苯，于显微镜下观察肝、肾组织病理变化。

2.6 血清代谢组学分析

2.6.1 样品处理 精密移取100 μL 血清于1.5 mL离心管中，加入300 μL 冰甲醇，涡旋15 s 后于4 ℃放置过夜。4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，在真空离心浓缩器中蒸发至近干，然后加入100 μL 含有同位素标记的胆酸（2 μg/mL）的70%甲醇溶液进行重新溶解，离心，收集上清液于200 μL 小瓶中，进行UPLC-Q-TOF/MS 分析。

2.6.2 色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱：0～2 min，20% B；2～12 min，20%～52% B；12～18 min，52%～65% B；18～22 min，65%～90% B；22～26 min，90%～20% B；26～30 min，20% B。体积流量0.3 mL/min；进样量2 μL。

2.6.3 质谱条件 带有负离子模式下的电喷雾电离（ESI）源，数据范围为50～2000。毛细管电压2.5 kV；取样锥电压40 V；离子源温度100 ℃；去溶剂温度500 ℃；锥形气体积流量100 L/h；MS1扫描时间为0.25 s，MS2扫描时间为0.10 s，仅采集前7 强母离子。

2.6.4 数据分析 UPLC-MS 原始数据在Waters MassLynx 软件上进行分析。通过Progenesis QI 软件导出CSV 格式文件，利用预测中的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）和单向方差分析的P值来识别潜在的生物标志物。通过将m/z和 MS/MS 片段离子与人类代谢组数据库（HMDB，http://www.HMDB.ca）进行比较，确定潜在的代谢标记物。使用 MetaboAnalyst 5.0（http://www.MetaboAnalyst.ca）对原始数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘法-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA），将整理好的潜在生物标记物导入MetaboAnalyst 进行通路分析，寻找与商陆醋制减毒相关的代谢通路。

2.6.5 9 种胆汁酸的半定量分析 精密称量9 种胆汁酸对照品，用含有同位素标记的胆酸（2 μg/mL）的70%甲醇溶液梯度稀释各胆汁酸对照品，配制9种胆汁酸。按“2.6.2”“2.6.3”项下条件进样，统计不同浓度下各胆汁酸的响应强度，以内标为参照，按照各胆汁酸响应强度/内标响应强度的比值进行响应强度归一化处理，构建胆汁酸浓度与归一化后的响应强度比值的标准曲线。统计各样本中9 种胆汁酸与内标的比值，根据标准曲线计算样本种各胆汁酸的相对含量。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 炮制前后商陆正丁醇部位皂苷类成分的鉴定及半定量分析

如图1 所示，采用Masslynx 对炮制前后商陆正丁醇部位的保留时间及分子离子峰进行统计，结合保留时间和特征碎片等信息，从生醋品商陆正丁醇部位中共推测鉴定出6 种皂苷类成分，见表1、2。

图1 商陆醋制前后正丁醇部位总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of n-butanol position before and after P.acinosa vinegar preparation

表1 正离子模式商陆醋制前后正丁醇部位成分分析Table 1 Analysis of components in n-butanol position before and after P.acinosa vinegar preparation in positive ion mode

3.2 血清生化分析

如图2 所示，与对照组比较，商陆生品能够呈剂量相关性地升高血清中ALT、AST 活性及BUN、Scr 水平（P＜0.05、0.01），表明商陆生品导致肝肾功能损伤，商陆醋品显著降低了生品所导致的肝肾功能指标的升高（P＜0.05），并呈剂量相关性。

图2 商陆醋制前后对小鼠血清生化指标的影响 (,n=4)Fig.2 Effect of P.acinosa before and after vinegar preparation on serum biochemical indexes in mice (,n=4)

3.3 肝、肾组织病理分析

如图3 所示，对照组小鼠肝细胞排列整齐有序，肝组织结构整体完好，中央静脉以中心向周围放射状排列，附近无炎症发生；生品商陆低剂量组肝组织细胞排列较乱，胞体较大，细胞变性明显，中央静脉周围炎症细胞浸润，部分细胞坏死；生品商陆高剂量组肝组织细胞排列混乱，肝细胞变性严重，胞体大，胞质疏松化，中央静脉周围炎症细胞浸润，脂肪空泡多，细胞坏死程度严重，肝损伤严重；醋品商陆高剂量组肝细胞排列略微紧凑，中央静脉周围炎症缓和，部分可见脂肪空泡和坏死细胞；醋品商陆低剂量组肝细胞排布整齐，中央静脉周围炎症反应少见，坏死细胞和脂肪空泡数量明显减少。

表2 负离子模式商陆醋制前后正丁醇部位成分分析Table 2 Analysis of components in n-butanol position before and after P.acinosa vinegar preparation in negative ion mode

图3 各组小鼠肝脏病理变化 (HE,×100)Fig.3 Pathological changes in liver of mice in each group (HE,× 100)

如图4 所示，对照组小鼠肾小球形态、大小正常，边界清晰，肾小管排列紧密整齐，内部刷状缘结构完整；生品低剂量组部分肾小球萎缩，肾小管上皮细胞空泡化，一些肾小管内部刷状缘结构较不完整，肾间质少量炎性细胞浸润；生品高剂量组肾小球萎缩，内皮和系膜细胞弥漫性增生，近曲小管结构消失，远曲小管继续扩张，肾小管上皮细胞坏死脱落到管腔中，内部刷状缘结构消失，肾间质炎性细胞浸润严重，部分肾间质纤维化；醋品高剂量组肾小球大小、形态较为正常，肾小管内部刷状缘结构较完整，部分肾小管呈现上皮细胞空泡化，存在轻微炎性细胞浸润；醋品低剂量组肾小球形态、大小正常，肾小管排列整齐紧密，内部刷状缘结构基本完整。

图4 各组小鼠肾脏病理变化 (HE,×100)Fig.4 Pathological changes in kidney of mice in each group (HE,× 100)

3.4 血清代谢组学的差异性分析

如图5、6 所示，与生品组比较，醋制组的血清代谢组与对照组更接近，说明商陆醋制后改善了生品导致的代谢紊乱。

图5 商陆醋制前后的PCA 得分图Fig.5 PCA score of P.acinosa before and after vinegar preparation

图6 商陆醋制前后的PLS-DA 得分图Fig.6 PLS-DA score of P.acinosa before and after vinegar preparation

3.5 血清代谢物鉴定

根据Progenesis QI 软件分析结果，筛选VIP＞1 的代谢物，进一步将筛选的代谢物通过m/z和MS/MS 片段离子与HMDB 数据库（http://www.HMDB.ca）进行比对，确定潜在的代谢物。共鉴定出50 种潜在代谢物（表3），其中11 种为胆汁酸。

表3 潜在生物代谢标记物的识别Table 3 Identification of potential biomarkers

3.6 通路富集分析

使用MetaboAnalyst 5.0 对鉴定的代谢物进行通路富集分析，阐述商陆醋制后调节何种代谢通路从而降低肝肾毒性作用，共发现11 条富集通路，其中初级胆汁酸代谢为最主要的代谢通路（图7）。

图7 通路富集分析Fig.7 Pathway enrichment analysis

进一步使用Masslynx 软件结合同位素胆酸内标，对初步鉴定的9 种胆汁酸进行半定量分析，比较各组血清中不同胆汁酸的含量差异，如图8 所示，部分次级胆汁酸（DCA、LCA）在商陆给药后含量显著升高（P＜0.05、0.01），醋制后能够减少次级胆汁酸的含量。而结合型胆汁酸（GCDCA、GDCA、TCDCA、TDCA）在生品给药后含量显著降低（P＜0.05、0.01），醋制后能够提高结合型胆汁酸的含量（P＜0.05、0.01）。但商陆醋制前后初级胆汁酸（CA、CDCA）的含量变化并不显著，并且醋制前后与对照组比较均无显著性差异。表明商陆醋制后可以通过减少次级胆汁酸的含量并增高结合型胆汁酸的含量改善生品诱导的胆汁酸代谢谱的改变，可能是其减毒的作用机制。

图8 9 种胆汁酸相对含量统计分析 (,n=6)Fig.8 Statistical analysis of relative content of nine bile acids (,n=6)

4 讨论

商陆为商陆科植物商陆P.acinosaRoxb.或垂序商陆P.americanaL.的干燥根，味苦、性寒；归肺、脾、肾、大肠经；具有逐水消肿、通利二便的功效[25]。商陆生品有毒，常采用醋制法炮制减毒，目前对商陆醋制减毒的研究主要集中在胃肠道方面，但胃肠道毒性反应仅仅是商陆毒性作用的一个方面。文献报道及课题组前期研究均显示商陆具有肝肾毒性作用[14-17,26-27]，并发现商陆主要毒性部位为正丁醇部位[12]，主要毒性成分为皂苷类成分[11]。基于此，本研究拟通过对商陆醋制前后肝肾毒性的比较并结合代谢组学的研究手段探索商陆醋制降低肝肾毒性的作用机制。

通过对醋制前后商陆正丁醇部位成分的分析发现，6 种皂苷类成分的含量在醋制后显著降低，推测可能是由于此类成分中的糖苷键结构不稳定，在醋制酸性以及加热的条件下发生水解生成苷元导致含量下降，但苷元及皂苷的毒性差异仍需进一步的实验研究。通过整体动物模型发现生品商陆会导致ALT、AST、BUN、Scr 等肝肾功能指标表达增高，醋制后能够显著降低这些指标，并呈剂量相关性。进一步通过肝、肾的组织病理切片证实商陆正丁醇部位会导致肝肾组织损伤，醋制后一方面肝脏炎症反应、脂肪空泡和坏死细胞明显减少；另一方面肾脏中肾小球形态接近正常组织、肾小管组织亦恢复正常，说明醋制确实能够减缓生品商陆的肝肾毒性作用。为了进一步阐明商陆醋制减毒的作用机制，进一步采用非靶向代谢组学对各组小鼠血清样本进行分析。PCA 及PLS-DA 的分析结果显示，生品商陆会导致小鼠代谢的紊乱，而醋制后能够改善代谢紊乱。进一步通过Progenesis QI 软件筛选VIP 值大于1 的代谢物，结合HMDB 和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）等公共数据库对代谢物的二级质谱图进行比对，初步筛选鉴定出50 种可能与商陆醋制减毒相关代谢物。对鉴定出的代谢物进行通路富集分析发现，10 种代谢途径可能与商陆醋制减毒相关，主要涉及初级胆汁酸合成、硫代谢、卟啉和叶绿素、酪氨酸和花生四烯酸的代谢等，而其中最显著的是初级胆汁酸生物合成代谢通路。

肝脏在胆汁酸代谢中占重要地位，与胆汁酸的合成、分泌、转化等密切相关，一些研究显示胆汁酸的变化可以作为肝损伤的代谢组学标志物，如栀子中京尼平苷可通过调节甘胆酸等多种胆汁酸代谢，尤其是初级胆汁酸的生物合成从而诱导肝损伤[23,28]。初级胆汁酸是一种重要的内源性代谢物，它们在肝脏中由胆固醇合成，并形成结合性胆汁酸后经由胆管分泌至肠道，在肠道菌群的作用下进一步代谢为次级胆汁酸，在空肠末端或回肠，通过门静脉系统再回流入肝脏，形成肝肠循环[29]。本研究发现胆汁酸代谢异常可能与商陆醋制减毒相关，为进一步探索商陆醋制前后如何影响胆汁酸代谢降低肝肾毒性的作用机制，本研究进一步对差异胆汁酸进行半定量分析，发现商陆能够增加血清中去氧胆酸、石胆酸等次级胆汁酸的含量并减少结合型胆汁酸的含量，醋制后能够提高结合型胆汁酸含量并降低次级胆汁酸含量，改善胆汁酸代谢谱的紊乱，说明商陆醋制后可以改善胆汁酸代谢失衡。研究显示，胆汁酸代谢谱的改变会造成肝脏炎性反应，导致肝脏的损伤，且次级胆汁酸的肝细胞毒性作用明显强于结合型胆汁酸[30-31]。另一方面，次级胆汁酸进入肾脏后，也会诱发肾小管上皮细胞的损伤，导致肾脏功能的受损[32]。基于此，本研究推测商陆导致的肝肾毒性可能与其导致的胆汁酸代谢紊乱密切相关，商陆醋制后可能会通过改善胆汁酸代谢失衡从而降低肝肾毒性作用。

此外，酪氨酸代谢及花生四烯酸代谢可能也与商陆醋制减毒相关[33-34]。酪氨酸代谢通路的产物甲状腺激素可以导致肝脏脂质代谢发生紊乱，进而使肝功能的进一步恶化[35]。花生四烯酸是生物体内分布最广泛且具有重要生物活性的一种omega-6 多不饱和脂肪酸[36]。花生四烯酸及其代谢产物可以影响环氧化酶P450 途径，参与各种组织的炎性反应，在肝脏功能损伤中具有重要作用[33]。硫代谢及卟啉和叶绿素代谢也是商陆醋制降低肝肾毒性的重要代谢通路。

本研究表明，商陆正丁醇部位可能是其导致肝肾毒性的主要部位，醋制后能够降低商陆正丁醇部位的肝肾毒性。商陆诱导的肝肾毒性与胆汁酸代谢紊乱相关，醋制能够显著改善胆汁酸代谢紊乱，从而降低肝肾毒性。但本研究也存在一些不足之处，如对胆汁酸代谢失衡缺乏深入的探索，研究显示胆汁酸代谢特别是结合型胆汁酸转化为次级胆汁酸需要肠道菌群参与，因此，本研究推测商陆醋制改善胆汁酸代谢失衡降低肝肾毒性作用可能与肠道菌群紊乱密切相关。后续研究中本研究将通过对肠道菌群的研究探索商陆醋制调节肠道菌群改善胆汁酸代谢紊乱的具体作用机制，推进商陆醋制减毒作用机制研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突