丁香酚对静电纺丝抑菌吸水衬垫结构和功能性质的影响

于 栋，冯旸旸，曹传爱，孔保华，连军强，刘 骞,

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.成都希望食品有限公司，四川 成都 610000）

抑菌吸水衬垫是指将抗菌剂添加到吸水材料中而制备出兼备抑菌和吸水作用的衬垫。其被广泛用于冷却肉包装中，用来吸附冷却肉在运输和销售过程中渗出的血水，改善冷却肉包装环境，延缓微生物生长繁殖，达到延长冷却肉货架期的作用[1]。目前抑菌吸水衬垫的制备方法主要有冻干法[2]和流延法[1]。但是这些方法存在吸水能力低，制备方法复杂等问题。近年来，静电纺丝作为一种连续制备纳米纤维的技术在食品领域备受关注。其是利用高压静电场作用实现将纺丝液制备为纳米纤维的一项技术[3]。在纺丝的过程中聚合物溶液受到电场力的作用被拉伸固化，最终在接收装置表面形成一层纳米纤维膜[4-5]。利用静电纺丝技术制备的吸水垫具有孔隙率大、比表面积高等优点[6-7]。适用于静电纺丝技术的基材主要有蛋白质（玉米醇溶蛋白[8]、明胶[9]等）、多糖（纤维素[10]、普鲁兰[11]等）和合成聚合物（聚乳酸[12]、聚乙烯醇[13]等）。其中聚乙烯醇是一种可降解的大分子材料，具有可纺性强，机械性能高以及安全无毒等诸多优点。由于聚乙烯醇侧链含有大量亲水基团，使得聚乙烯醇纳米纤维具有较强的吸水和锁水能力，其可作为一种新型吸水材料应用于冷却肉保鲜中。

植物源抑菌剂具有较高的安全性，将其用于食品包装是现代包装材料的发展趋势之一。植物来源的抗菌物质主要有植物精油、中草药提取物、果胶提取物[14]。其中，丁香酚是一种从丁香中提取的天然香料，具有抗菌和抗氧化等生物活性。但是丁香酚易受加工条件（加热、高压、酸碱性等）的影响，降低其自身的抗氧化和抑菌效果。因此，对丁香酚进行包埋处理是一种切实可行的解决方案。静电纺丝技术具备优异的包埋能力，可以有效的将丁香酚包埋到纳米纤维吸水垫中制备活性包装材料。Kayaci等[15]利用静电纺丝技术包埋丁香酚制备了抑菌纳米纤维膜，研究结果表明被包埋的丁香酚可以从纳米纤维膜中缓慢稳定释放，其在活性包装方面具有广阔的应用前景。

本课题组前期研究了聚乙烯醇的最佳纺丝浓度以及柠檬酸的最适交联浓度[16]，在此基础上本实验基于静电纺丝技术制备了兼备高吸水性和抑菌性的吸水衬垫，研究丁香酚添加量对抑菌吸水衬垫结构及功能性质的影响，以期为静电纺丝抑菌吸水垫在食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬酸 国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯醇上海迈瑞尔化学技术有限公司；丁香酚 上海源叶生物科技有限公司

1.2 仪器与设备

DFS-001高压静电纺丝机 北京新凯伟科技有限公司；SU8010扫描电子显微镜 日本日立集团；Nicolet iS-50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Scientific公司；RW20机械搅拌机 德国IKA公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DMA Q800热机械分析仪 德国耐驰仪器公司；Discovery DHR-1流变仪 美国TA仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 静电纺丝吸水垫的制备

配制纺丝溶液：首先配制质量分数为7.5%的聚乙烯醇溶液，加入20 mg柠檬酸，然后称取一定量的丁香酚加入其中。最终配制成添加丁香酚0%、5%、10%、15%、20%（以聚乙烯醇质量计）的纺丝溶液。

静电纺丝吸水垫的制备：将所得混合溶液移至10 mL注射器中，静电纺丝吸水垫的制备采用电压调节直流电源，施加电压为15 kV，进样速率为0.24 mL/h，接收距离为12 cm。然后将收集得到的纳米纤维进行加热处理，加热条件为130 ℃、8 min，最终得到酯化交联的静电纺丝吸水垫，流程见图1。

图1 静电纺丝吸水垫制作流程图Fig.1 Production flow chart of electrospun absorbent pads

1.3.2 溶液性质测定

1.3.2.1 电导率的测定

参照Altan等[17]的方法，将电导率仪Delta 326的探头放入上述配制的溶液中进行测定，重复3 次。

1.3.2.2 表面张力的测定

参照Drosou等[18]的方法，利用DCAT21表面张力测定仪通过动态白金板法测定，重复3 次。

1.3.2.3 黏度的测定

参照Drosou等[18]的方法，并稍作修改。通过DHR-1旋转流变仪在0～200 s-1剪切速率范围内采用动态剪切流变仪进行稳态剪切流变实验，以表征纺丝溶液的表观黏度。其中测量温度25 ℃、平板直径40 mm、间隙高度1 mm。

1.3.2.4 pH值的测定

采用pH计在室温（25 ℃）下测定各个纺丝溶液的pH值，每个样品重复3 次。

1.3.3 抑菌纺丝吸水垫形貌分析

参照Liu Yini等[19]的方法，剪取适当纳米纤维样品，将其直接粘在导电胶上，然后在真空环境中进行喷金处理，加速电压5.0 kV，工作距离11.5 mm。挑选放大倍数50000的图片并保存。利用电脑软件Diameter-J对直径统计分析。

1.3.4 抑菌纺丝吸水垫红外分析

采用傅里叶变换红外光谱仪测量纳米纤维的红外吸收光谱，光谱范围500～4000 cm-1，扫描次数64。

1.3.5 抑菌纺丝吸水垫热重分析

参照Li Mi等[20]的方法，称取大约7 mg纺丝吸水垫于氧化铝坩埚中，设置加热温度范围为30～600 ℃，加热速率为10 ℃/min，设定加热过程以氮气作为保护气，氮气速率为50 mL/min。

1.3.6 抑菌纺丝吸水垫机械分析

抑菌纺丝吸水垫的机械性能利用质构仪进行分析。按照质构仪对样品的要求，剪裁抑菌纺丝吸水垫长×宽为30 mm×5 mm，使用薄膜夹具固定抑菌纺丝吸水垫。设定触发力为5 g，测试速率为5 mm/s，夹具拉伸距离为10 cm。

1.3.7 纺丝吸水垫溶胀率和溶胀损失测定

溶胀率测定采用Mayachiew等[21]的方法。首先将干燥至恒质量的样品剪成相同大小（3 cm×3 cm）并记录其质量m0，称量之后将样品置于30 mL的蒸馏水中浸泡24 h，然后用滤纸将样品表面水分吸干，记录其质量m1。溶胀率（Q1）计算公式如下：

溶胀损失测定采用Khoshgozaran-Abras等[22]的方法。首先将干燥至恒质量的样品剪成相同大小（3 cm×3 cm）并记录其质量m0，称量之后将样品放置30 mL的蒸馏水中浸泡24 h，然后将样品烘干至恒质量记录其质量为m2。溶胀损失（Q2）计算公式如下：

1.3.8 水蒸气透过率测定

参照Allafchian等[23]的方法进行测定并稍作修改。首先测定吸水垫的厚度，并将其剪裁成5 cm×5 cm大小的正方形。然后在10 mL小烧杯中放入1 g氧化钙，最后用吸水垫将烧杯封口，对其进行称量。封口后的烧杯置于底部有饱和氯化钾的干燥器中，每隔24 h进行称质量，持续7 d。水蒸气透过率计算公式如下：

式中：WVP为水蒸气透过率/（g/（m·s·Pa））Δm为膜的增加质量/g；x为膜的厚度/mm；A为膜的面积/m2；Δt为时间/s；Δp为膜两侧的大气压差/Pa。

1.3.9 抗氧化能力测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率参照Aydogdu等[24]的方法并稍作修改。首先将一定质量的抑菌纺丝吸水垫浸泡在50 mL甲醇溶液中24 h，然后吸取100 μL吸水垫浸泡液与3.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合。混合之后避光反应2 h，利用紫外-可见分光光度计测量517 nm处反应液的吸光度Asample。以甲醇溶液作为空白对照，测其吸光度为Acontrol。自由基清除率计算公式如下：

2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除率测定参照Fonseca等[25]的方法并稍作修改。将一定质量的抑菌纺丝吸水垫浸泡在50 mL甲醇溶液中24 h，备用。配制7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾等体积混合，避光16 h后用甲醇稀释反应液，使得反应液在734 nm处的吸光度为0.7。然后吸取100 μL吸水垫浸泡液与2 mL反应溶液混合，避光静置6 min后利用紫外-可见分光光度计测量734 nm处反应液的吸光度Asample。以甲醇溶液作为空白对照，测其吸光度为Acontrol。自由基清除率计算公式同上。

1.3.10 细菌生长曲线测定

参照刘世旺等[26]的方法并稍作修改。首先在无菌操作台上将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种于液体培养基中，然后将培养基放置在37 ℃的摇床培养箱中活化两代，活化完成的细菌数量为107～108CFU/mL，备用。将经紫外线灭菌的抑菌纺丝吸水垫裁剪成正方形（5 cm×5 cm）小块，并将其浸入到20 mL无菌生理盐水中，37 ℃振荡24 h使丁香酚充分释放，得到抑菌纺丝吸水垫提取液。然后将200 μL活化完成的细菌悬液和100 μL抑菌纺丝吸水垫提取液注入到蜂窝微孔板孔中。用bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪测定600 nm处菌液的吸光度。温度设置为37 ℃，恒温培养24 h，每隔30 min测量一次吸光度。对每个样品分别进行3 次测量。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 丁香酚添加量对纺丝溶液性质的影响

从图2可以观察到，随着剪切速率的增加，所有溶液的表观黏度均下降，表现出剪切稀释行为。另外，纺丝溶液的表观黏度随着丁香酚添加量的增大表现出整体下降的趋势，但是下降幅度并不大，这可能是由于丁香酚和聚乙烯醇两者发生乳化作用导致。

图2 不同丁香酚添加量溶液的剪切稀释曲线Fig.2 Viscosity versus shear rate curves of spinning solution with different amounts of added eugenol

由表1可以看出，添加丁香酚纺丝溶液的表面张力值与未添加丁香酚的纺丝溶液相比具有较大差别，但是表面张力并未随着丁香酚添加量的增多而出现变化。不同溶液的电导率也没有表现出明显的差异，电导率在4.8～4.6 mS/cm左右小范围波动。另外丁香酚的添加对纺丝溶液pH值影响不大。

表1 不同丁香酚添加量溶液的溶液性质Table 1 Properties of spinning solution with different amounts of added eugenol

2.2 丁香酚添加量对纳米纤维吸水垫形貌的影响

从图3可以看出，未添加丁香酚的纳米纤维呈随机错综分布，纤维形态均一，纤维直径主要集中在100～200 nm之间。随着纺丝溶液里丁香酚添加量的增大，纳米纤维形貌中“囊泡”状结构也随之逐渐增多，这是因为丁香酚和聚乙烯醇溶液极性相反，静电纺丝过程中溶剂迅速蒸发后，会导致纤维中嵌入“囊泡”状结构。Camerlo等[27]研究以聚乙烯醇为基质包埋柠檬烯制备乳液静电纺丝时也得到了相似的结论。从图3还可以看出，丁香酚添加量还会影响纳米纤维吸水垫的形态。丁香酚添加量为5%和20%时，纤维形态均不理想，纺丝射流并没有被细化拉伸成形态均一的纳米纤维。

图3 不同丁香酚添加量纳米纤维吸水垫扫描电镜图及纤维直径分布Fig.3 SEM images and fiber diameter distribution of electrospun nanofiber pads with different amounts of added eugenol

2.3 抑菌纳米纤维吸水垫红外光谱分析

从图4可以观察到，丁香酚的红外光谱在3520、3100～2790、1512、1264 cm-1处显示出特征吸收峰，分别对应于官能团是O—H弯曲、C—H伸缩振动、C＝C伸缩振动、C＝O伸缩振动[28]。此外，在含有丁香酚的纳米纤维吸水垫中，观察到丁香酚特征峰如1512 cm-1烯烃特征峰，其吸收强度随丁香酚添加量的增多而增强，证实了丁香酚被包埋到纳米纤维吸水垫中。还有其他一些峰出现减弱或者消失的现象，表明丁香酚与聚乙烯醇溶液之间存在分子间或者分子内的相互作用。

图4 不同丁香酚添加量纳米纤维吸水垫的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of nanofiber pads with different eugenol contents

2.4 抑菌纳米纤维吸水垫热重分析

采用热重分析可以表征纳米纤维吸水垫的热稳定性[29]，同时由于丁香酚的加入，其热重曲线会表现出一定程度上的差异，故也可通过热重曲线表征丁香酚包合物的形成。热重曲线上每一个台阶代表物质的分解。从图5可以看出，丁香酚热稳定性较差，仅发生一次降解，在导数曲线中可以直观看到其最大降解速率对应的温度在180 ℃左右，在200 ℃时完全分解。纳米纤维样品均发生3 次降解。第1次是水分子的蒸发，第2次对应大分子侧链的降解，第3次是聚合物主链分解，样品主要降解发生在第2阶段[30]。不同添加量丁香酚纳米纤维的降解曲线大致相同，虽然加入丁香酚会降低纳米纤维的热稳定性，但其影响并不大。

图5 不同丁香酚添加量纳米纤维吸水垫失重曲线（a）和失重微分曲线（b）Fig.5 TGA curves (a) and DTG curves (b) of nanofiber pads with different eugenol contents

2.5 抑菌纳米纤维吸水垫机械性能分析

从图6a可以看出，所有纳米纤维吸水垫的应力应变曲线呈现微弯的曲线。纳米纤维吸水垫的断裂伸长率随丁香酚的增加而下降（P＜0.05）（图6b）。如图6c所示，加入5%和20%丁香酚均会导致纳米纤维吸水垫抗拉伸强度显著下降（P＜0.05）。加入10%和15%丁香酚会使纳米纤维吸水垫抗拉伸强度稍有上升。这可能是因为抑菌纳米纤维吸水垫的纳米网状结构以及丁香酚与聚乙烯醇相互作用造成[31]。另外丁香酚的反增塑作用也可能影响抑菌纳米纤维吸水垫的机械性能。这一结果也同扫描电镜结果相呼应，说明丁香酚对纳米纤维吸水垫的机械性能有较大影响。

图6 不同丁香酚添加量纳米纤维吸水垫的机械性能Fig.6 Mechanical properties of nanofiber pads with different eugenol contents

2.6 抑菌纳米纤维吸水垫溶胀率、溶胀损失和水蒸气透过率分析

从表2可以看出，随着丁香酚添加量的增加，纳米纤维吸水垫的溶胀率逐渐降低（P＜0.05），当丁香酚添加量为10%和15%时，二者纳米纤维吸水垫的溶胀率并无显著差异。虽然丁香酚添加量较低时对纳米纤维吸水垫的溶胀损失影响不大，但是当丁香酚添加量增加到20%时，溶胀垫的溶胀损失会显著上升（P＜0.05），高于其他样品。这可能和纳米纤维吸水垫的微观结构有关，当丁香酚添加量为20%时，纳米纤维吸水垫的微观结构已经被破坏。纳米纤维吸水垫的水蒸气透过率和丁香酚添加量有关，当丁香酚添加量增加时，纳米纤维吸水垫的水蒸气透过率会显著下降（P＜0.05）。

表2 不同丁香酚添加量纳米纤维吸水垫的溶胀率、溶胀损失和水蒸气透过率Table 2 Swelling ratio,water solubility and water vapor permeability of nanofiber pads

2.7 抑菌纳米纤维吸水垫抗氧化能力分析

通过DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除实验测定含丁香酚纳米纤维吸水垫的体外抗氧化能力，以研究丁香酚被包埋到纳米纤维吸水垫抗氧化活性变化情况。如图7所示，包埋丁香酚的纳米纤维吸水垫具有自由基清除活性，可以将稳定的紫色DPPH自由基溶液还原成黄色，也可以将蓝绿色的ABTS阳离子自由基溶液还原为无色。如预期的那样，丁香酚添加量对自由基清除活性有直接关系，抑菌纳米纤维吸水垫对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的抗氧化活性均随着丁香酚添加量的增加而增加。当丁香酚添加量为20%时对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力最强，清除率分别为83%和78%。对于未包埋的纳米纤维吸水垫也进行了抗氧化能力实验，但其未显示出自由基清除活性。

图7 不同丁香酚添加量纳米纤维吸水垫的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率Fig.7 DPPH radical and ABTS radical cation scavenging activity of nanofiber pads loaded with different amounts of eugenol

2.8 抑菌纳米纤维吸水垫的抑菌能力分析

从图8可以看出，对照组细菌生长最快，吸光度最高。随着丁香酚添加量的增加，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用随之加强。丁香酚添加量越高，细菌生长曲线的吸光度越低，相应的抑制率越高。从抑制率曲线可以看出，抑制率并不是持续增加的趋势，其随着细菌生长周期不断变化。刚开始时由于细菌数量少，因此丁香酚抑制率急剧上升。随后随着细菌快速繁殖，抑制率开始下降，然后由于丁香酚的释放量不断增加，抑制率再次增加。最后，丁香酚的释放低于细菌的繁殖率，导致抑制率降低并达到其最小值。

图8 大肠杆菌（a、b）和金黄色葡萄球菌（c、d）的生长曲线和抑菌率曲线Fig.8 Growth and inhibition curves of E.coli (a,b) and S.aureus (c,d)after exposure to nanofibers with eugenol

3 结论

基于静电纺丝技术包埋丁香酚制备了一种兼具高吸水性和抑菌性的吸水衬垫，研究丁香酚添加量对吸水衬垫材料特性和功能特性的影响。从扫描电镜图可以看出丁香酚添加量为15%时，纳米纤维形貌较好。虽然丁香酚添加量增加，吸水衬垫的溶胀率随之下降，但是当丁香酚添加量为15%时，吸水衬垫的溶胀率仍在400%以上，说明纳米纤维吸水垫仍具备较强的吸水能力。与此同时，丁香酚添加量为15%时吸水衬垫的抗拉神强度最高。抗氧化和抑菌实验表明，随着丁香酚添加量增加，纳米纤维吸水垫的抗氧化能力和抑菌能力均随之增强。综合以上实验数据，丁香酚添加量为15%时纳米纤维吸水衬垫功能性质最佳。因此，利用静电纺丝技术包埋丁香酚制备的抑菌吸水垫具有较好的吸水能力和抑菌效果，本实验为冷却肉贮藏保鲜提供参考。